【检测技术科普】2026-06-28 CRISPR 诊断技术（SHERLOCK、DETECTR）详解

概述

CRISPR 诊断（CRISPR-Dx）是一类基于 Cas 蛋白"靶向识别 + 旁路切割（trans-cleavage）"特性，将核酸检测转化为可读信号的分子诊断技术。代表性平台包括基于 Cas13a 的 SHERLOCK（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing，张锋团队于 2017 年首次报道于 Science）和基于 Cas12a/Cas14 的 DETECTR（DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter，Jennifer Doudna 团队于 2018 年报道于 Science）。其核心价值在于可在等温条件下实现阿托摩尔（aM，10⁻¹⁸ mol/L）级别的核酸检测，单分子灵敏度，并可结合侧向流试纸条形成可视化 POCT 结果。2020 年 5 月，SHERLOCK 成为全球首个获得 FDA 紧急使用授权（EUA）的 CRISPR 诊断试剂，用于 SARS-CoV-2 检测。

一、原理

CRISPR 诊断的核心利用了 Cas 蛋白的"旁路切割活性（collateral / trans-cleavage activity）"：当 Cas 蛋白与 crRNA 形成核糖核蛋白复合物（RNP）并特异性识别靶标核酸后，会进入激活态，对周围非特异性单链核酸（ssRNA 或 ssDNA）进行无差别切割。这一原本被视为"脱靶副反应"的特性，被巧妙转化为信号放大的分子开关——只要在反应体系中加入带有荧光/猝灭基团的报告分子（reporter），一旦靶标存在即可触发强烈的荧光信号释放或侧向流试纸条显色。

（一）SHERLOCK（Cas13a 体系）

SHERLOCK 使用来源于 Leptotrichia wadei（LwaCas13a）或 Leptotrichia shahii（LshCas13a）的 Cas13a（旧称 C2c2），属 Class II Type VI CRISPR 系统，靶标为 单链 RNA（ssRNA）。Cas13a 含有两个 HEPN 结构域，识别靶标后表现为 RNA 引导的 RNA 核酸内切酶活性，并启动对任意 ssRNA 的旁路切割。Cas13a 需 crRNA 的间隔序列与靶标完全匹配，并对前间隔序列侧翼位点（PFS，即原间隔序列紧邻 3' 端的非 G 碱基）有一定偏好性。报告分子为带有荧光（FAM）/猝灭（Iowa Black）基团的短链 RNA（如 5'-FAM-UUUUU-Iowa Black-3'），一旦被切割，荧光信号释放。

Gootenberg 等 2017 年首次报道时，即已将检测灵敏度推至 阿托摩尔（aM）级别，并能区分单碱基错配；该研究采用重组酶聚合酶扩增（RPA）作为预扩增步骤，结合 T7 RNA 聚合酶体外转录，将 DNA 信号转换为 RNA 信号供 Cas13a 识别，从而实现 RNA 与 DNA 双重检测[1]。

（二）DETECTR（Cas12a 体系）

DETECTR 使用 Cas12a（旧称 Cpf1），属 Class II Type V 系统，靶标为 双链 DNA（dsDNA）。Chen 等 2018 年首次报道 Cas12a 在 crRNA 引导下识别双链 DNA 靶标后，会激活对单链 DNA（ssDNA）的旁路切割活性。Cas12a 识别富含 T 的 PAM 序列（典型为 5'-TTTV-3'，V 为 A/C/G），其报告分子为 5'-FAM-TTATT-Iowa Black-3' 一类的短链 ssDNA。该团队结合等温扩增（如 RPA）建立 DETECTR 平台，对 HPV16/HPV18 病毒 DNA 实现 attomolar 灵敏度检测，并在 60 分钟内完成分析[2]。

（三）Cas14-DETECTR

2018 年，Harrington 等在 Science 报道了来自未培养古菌的 Cas14 家族（400–700 氨基酸，仅为 Cas9/Cas12 的 1/2 大小）。Cas14 靶向 ssDNA，不依赖严格的 PAM 序列，更适合 SNP 分型。通过利用其 ssDNA 旁路切割活性，该团队建立 Cas14-DETECTR 体系，可对 HERC2 基因眼色相关 SNP 进行高保真分型[3]。

（四）SHERLOCKv2 多通道与级联放大

Gootenberg 等 2018 年在 Science 报道 SHERLOCKv2：① 利用正交 Cas 酶（Csm6、PsmCas13b、LbaCas13a 等）实现单管 4 通道检测；② 引入辅助酶 Csm6 将检测灵敏度再提升约 3.5 倍；③ 定量检测下限低至 2 aM；④ 加入侧向流试纸条读出，实现可视化 POCT[4]。

（五）STOPCovid 一锅法

Joung 等 2020 年在 NEJM 报道 STOPCovid（SHERLOCK Testing in One Pot）：将 RT-LAMP 与 Cas12b（来源于 Alicyclobacillus acidiphilus，耐热）整合到单管单一温度反应中，约 60 分钟即可完成 SARS-CoV-2 检测，灵敏度与 RT-qPCR 相当，且最大限度减少操作步骤与气溶胶污染风险[5]。

二、操作流程

以 SHERLOCK/DETECTR 为代表的 CRISPR 诊断标准流程包括四个主要步骤。整体可在 1–2 小时内完成，远短于传统培养与 RT-qPCR。

步骤 1：核酸提取

从临床样本（鼻咽拭子、唾液、血清、尿液、肺泡灌洗液等）中提取 DNA 或 RNA。对于现场快检，Myhrvold 等 2018 年开发的 HUDSON（Heating Unextracted Diagnostic Samples to Obliterate Nucleases）可直接加热裂解病毒颗粒并灭活样本中的核酸酶，省去 RNA 提取步骤，使 DENV 的无仪器检测在 2 小时内完成[6]。

步骤 2：等温扩增（可选但通常必要）

• RPA（Recombinase Polymerase Amplification）：37–42°C，5–20 分钟，适用于 SHERLOCK 原始方案。
• RT-RPA / RT-LAMP：分别用于 RNA 病毒检测；STOPCovid 采用 RT-LAMP + Cas12b 的组合[5]。
• 无扩增检测：最新研究方向是利用 CRISPR 自身的高灵敏度直接检测，省去扩增步骤，但灵敏度通常较低。

步骤 3：CRISPR-Cas 旁路切割反应

将 crRNA 与 Cas 蛋白预组装为 RNP，加入扩增产物与荧光报告分子，在 37°C（SHERLOCK/Cas13a、DETECTR/Cas12a）或 55–60°C（STOPCovid/Cas12b）孵育 15–60 分钟。当靶标存在时，crRNA 引导 RNP 结合并触发旁路切割反应，释放荧光信号。

步骤 4：信号读出

• 荧光读出：实时荧光定量（qPCR 仪或便携式荧光仪）。
• 侧向流试纸条读出：试纸条含检测线（T）和质控线（C），类似妊娠试纸，无需任何仪器；特别适合 POCT 与现场检测。
• 比色读出：通过可视化颜色变化判读结果，更适合资源有限地区。

三、应用场景

（一）感染性疾病病原体检测

• 呼吸道病毒：SHERLOCK 已被广泛用于 SARS-CoV-2、寨卡病毒（ZIKV）、登革热病毒（DENV）检测。Gootenberg 等 2017 年的研究展示了 SHERLOCK 对 ZIKV 和 DENV 的单拷贝/μL 级别检测能力[1]；Myhrvold 等 2018 年通过 SHERLOCK+HUDSON 实现了从患者样本中直接检测 DENV 并区分 4 种血清型[6]。STOPCovid 则提供了 1 小时内单管完成的 SARS-CoV-2 检测方案[5]。
• 细菌与耐药基因：SHERLOCK 与 DETECTR 已用于 Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella pneumoniae、Mycobacterium tuberculosis 等病原体及耐药基因（blaKPC、vanA、mecA 等）的检测。
• 性传播感染：DETECTR 用于 HPV16/HPV18 高危亚型检测，灵敏度达 aM 级[2]。
• 病毒性肝炎：CRISPR/Cas13a 系统已被用于 HBV DNA 低病毒载量患者的检测。

（二）肿瘤液体活检与基因分型

SHERLOCK 通过对 cfDNA 中 EGFR L858R 与 BRAF V600E 等肿瘤驱动突变的检测，展示了其在液体活检中的应用前景。Cas14-DETECTR 利用无 PAM 限制的特点实现了 SNP 高保真分型[3]。

（三）农业、食品安全与环境监测

CRISPR-Dx 同样适用于转基因作物成分鉴定、食源性病原体（如沙门氏菌、单增李斯特菌）检测以及环境中抗生素抗性基因监测。

（四）现场快速检测与疫情应急

Sherlock Biosciences 于 2020 年 5 月 7 日 获得 FDA 颁发的首个 CRISPR 诊断 EUA（Sherlock™ CRISPR SARS-CoV-2 Kit，检测 ORF1ab 与 N 基因，~1 小时出结果）；Mammoth Biosciences 的 SARS-CoV-2 DETECTR Reagent Kit 于 2021 年 7 月获 FDA EUA，后其高通量版本 DETECTR BOOST 于 2022 年 1 月获 EUA，可在临床实验室每日完成数千份测试[7][8]。

四、优缺点

（一）优势

• 超高灵敏度：单分子级别（aM 级）灵敏度，与数字 PCR 相当甚至更优[1][2]。
• 高特异性：crRNA 引导识别可区分单碱基差异，适合 SNP 分型与病毒亚型鉴定[3]。
• 等温反应：37°C 或单一温度即可反应，无需传统 PCR 的热循环仪，特别适合 POCT 与资源有限地区。
• 可视化读出：侧向流试纸条/BYZ 颜色变化，无需复杂仪器。
• 可冻干与冷链独立：试剂可冻干保存，现场加水即可复溶，适合偏远地区与现场流行病学调查[1]。
• 可编程性强：只需更换 crRNA 即可快速适配新靶标，从序列设计到验证可在一周内完成[6]。
• 多通道潜力：SHERLOCKv2 已实现单管 4 通道并行检测，适合症候群病原体组合筛查[4]。

（二）局限

• 多数平台仍需预扩增：RPA/LAMP 增加步骤与气溶胶污染风险；真正无扩增检测的灵敏度尚不足以应对低载量样本。
• PAM 依赖性：Cas12a 需要典型 5'-TTTV-3' PAM，Cas13a 偏好 PFS 非 G，这些限制在某些靶标位点上会减少可选区域。Cas14 部分规避此问题但仍未广泛商业化[3]。
• 多靶点检测仍有挑战：尽管 SHERLOCKv2 已实现 4 通道，但稳定、低交叉反应的临床级多重检测仍是技术瓶颈[4]。
• 临床验证与监管：相比成熟的 RT-qPCR，CRISPR-Dx 的临床性能验证数据、长期质控体系仍不够完善，多数产品仍处于 EUA 而非正式 FDA 上市许可状态。
• 标准化与自动化不足：试剂与操作流程的标准化、自动化平台（如集成微流控芯片）尚不普及，影响其在大型临床实验室的常规化部署。
• 定量能力有限：侧向流读出多为定性结果；荧光读出可定量，但需依赖荧光仪。

五、报告解读

CRISPR 诊断的报告解读与 RT-qPCR 有相似之处，也有显著差异。

（一）侧向流试纸条读出

• 检测线（T）出现 + 质控线（C）出现：靶标阳性。
• 仅 C 线出现：靶标阴性。
• C 线未出现：结果无效，需重新检测（提示试剂失效或操作错误）。
• T 线弱阳性：可能为低病毒载量样本，建议结合临床与 RT-qPCR 复核。

（二）荧光读出

• Ct/TT（threshold time）值：荧光信号超过阈值的反应时间，类似于 RT-qPCR 的 Ct 值。
• 判读标准：建立阴性对照、阳性对照及内对照（如人 RNase P POP7 基因用于 Sherlock™ SARS-CoV-2 Kit）。靶标基因（如 SARS-CoV-2 ORF1ab、N 基因）检出且内对照阳性 → 阳性；靶标未检出且内对照阳性 → 阴性；内对照阴性 → 结果无效。
• 定量：基于标准曲线可对靶标浓度进行估算（拷贝数/μL），但 CRISPR-Dx 目前的定量精度仍弱于 RT-qPCR/dPCR。

（三）临床判读注意事项

• 检测下限（LOD）：各平台 LOD 不同（attomolar 至低拷贝/μL 级别），需结合临床判断阴性结果的意义，不能单独排除感染。
• 采样质量：鼻咽拭子、唾液等样本采集质量直接影响结果。
• 感染阶段：病毒血症/排毒期之外可能出现假阴性。
• 干扰因素：样本中的黏液、血液、蛋白等基质成分可能抑制反应，需在试剂开发与质控中评估。
• 与其他方法不一致时：建议使用不同方法学（如 RT-qPCR）进行复检，特别是低病毒载量或临界值样本。

（四）质量控制

• 空白对照（NTC）：排除试剂污染。
• 阳性对照：评估试剂活性。
• 内对照（如 RNase P）：评估采样与提取效率，Sherlock™ SARS-CoV-2 Kit 即采用人 RNase P POP7 作为内对照[7]。
• 标准操作程序（SOP）：建议实验室建立完整的 SOP 并定期进行人员比对与室间质评。

参考文献

[1] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2[J]. Science, 2017, 356(6336): 438-442. DOI: 10.1126/science.aam9321. (PMID: 28408723)

[2] Chen JS, Ma E, Harrington LB, et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity[J]. Science, 2018, 360(6387): 436-439. DOI: 10.1126/science.aar6245.

[3] Harrington LB, Burstein D, Chen JS, et al. Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes[J]. Science, 2018, 362(6416): 839-842. DOI: 10.1126/science.aav4294. (PMID: 30337455)

[4] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6[J]. Science, 2018, 360(6387): 439-444. DOI: 10.1126/science.aaq0179.

[5] Joung J, Ladha A, Saito M, et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot Testing[J]. N Engl J Med, 2020, 383(15): 1492-1494. DOI: 10.1056/NEJMc2026172.

[6] Myhrvold C, Freije CA, Gootenberg JS, et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13[J]. Science, 2018, 360(6387): 444-448. DOI: 10.1126/science.aas8836.

[7] U.S. Food and Drug Administration. Sherlock CRISPR SARS-CoV-2 Kit – Instructions for Use[EB/OL]. Silver Spring: FDA, 2020-05-07[2026-06-28]. https://www.fda.gov/media/137746/download

[8] Sherlock Biosciences. Sherlock Biosciences Receives FDA Emergency Use Authorization for CRISPR SARS-CoV-2 Rapid Diagnostic[EB/OL]. Cambridge: Sherlock Biosciences, 2020-05-07[2026-06-28]. https://sherlock.bio/wp-content/uploads/2020/05/Sherlock-EUA-Announcement_FINAL.pdf

[9] Kellner MJ, Koob JG, Gootenberg JS, et al. SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases[J]. Nat Protoc, 2019, 14(10): 2986-3012. DOI: 10.1038/s41596-019-0210-2. (PMID: 31548639)

[10] Yoshimi K, Takeshita K, Yamayoshi S, et al. CRISPR-Cas3-based diagnostics for SARS-CoV-2 and influenza virus[J]. iScience, 2022, 25(2): 103830. DOI: 10.1016/j.isci.2022.103830.

[11] Wang Z, Wang Q. CRISPR-driven diagnostics: molecular mechanisms, clinical applications, and future perspectives[J]. Clin Transl Med, 2025: e70482. DOI: 10.1002/ctm2.70482.