【检测技术科普】2026-07-12 免疫组化染色（IHC）详解

概述

免疫组化染色（Immunohistochemistry，IHC）是一种将免疫学原理与组织化学技术相结合的重要检测方法，通过特异性抗原-抗体反应，在组织切片上对目标蛋白（抗原）进行定性、定位和半定量分析。IHC 融合了组织学、免疫学和生物化学的技术手段，使其成为病理诊断和生物医学研究中不可或缺的工具[1]。自 1941 年 Coons 等首次将荧光标记抗体用于组织切片中肺炎球菌抗原的检测以来，IHC 历经八十余年的发展，已从实验室研究工具演变为临床病理诊断的常规核心技术[2]。IHC 的关键优势在于，它不仅能评估蛋白表达水平，还能在保持组织完整形态结构的前提下，精确显示目标蛋白在细胞内的亚定位——细胞核、细胞质还是细胞膜——这是 Western blot 或 ELISA 等分子生物学技术所不具备的空间信息[1]。

IHC 在感染性疾病诊断、肿瘤分类与分型、神经退行性疾病研究、药物开发及预后预测等领域发挥着至关重要的作用。在感染性疾病领域，IHC 特别适用于难以培养、生长缓慢或含量极低的病原体检测，通过特异性抗体直接在石蜡包埋组织切片中显示病毒、细菌或真菌抗原[2]。

一、原理

IHC 的核心原理基于免疫学中的抗原-抗体特异性结合反应，通过标记物（酶、荧光素或金属颗粒）将这种不可见的结合转化为可在显微镜下观察的信号[1]。

直接法：标记一抗直接与组织切片中的靶抗原结合。流程简单、步骤少、非特异性背景低，但灵敏度相对较差，每个靶抗原仅结合一个标记抗体，信号放大效应弱[3]。

间接法：先用未标记的一抗与靶抗原结合，再用标记的二抗（抗一抗种属 IgG）与一抗结合。由于多个二抗分子可与一个一抗分子结合，信号得到显著放大，灵敏度大幅提高，是目前临床诊断中最常用的方法[1,3]。

信号检测系统主要分为两类：

• 显色检测系统：采用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）标记抗体，催化底物生成不溶性有色沉淀。最常用的显色剂为 DAB（3,3'-二氨基联苯胺），生成棕色沉淀，在普通光镜下即可观察，信号长期稳定[4]。AP 红色显色剂主要用于皮肤等含黑色素的组织，避免棕色 DAB 信号被内源性黑色素掩盖。
• 荧光检测系统：以荧光素（如 FITC、Cy3、Cy5）或量子点标记抗体，在荧光显微镜下检测信号，灵敏度极高，适用于多重标记和共聚焦成像，但信号易淬灭、需特殊设备[1]。

抗原修复（Antigen Retrieval）：福尔马林固定过程中，甲醛会在蛋白间形成亚甲基桥交联，掩蔽抗原表位。因此，IHC 染色前必须通过加热（微波、高压或水浴）或酶消化（蛋白酶 K、胰酶）等方式打破交联，暴露抗原表位，恢复抗体结合能力。热诱导抗原修复（HIER）是目前最常用且效果最好的方法[1,5]。

二、操作流程

IHC 的标准化操作流程包括以下关键步骤[1,3,4]：

1. 组织固定与处理

• 组织离体后尽快用 10% 中性缓冲福尔马林固定，固定时间 6-48 小时
• 固定不足或过度均会影响抗原性，导致染色不均或假阴性
• 固定后常规脱水、石蜡包埋（FFPE），或使用冰冻切片（适用于部分对固定敏感的抗原）

2. 切片制备

• FFPE 块切成 3-5 μm 薄片，贴附于带正电荷或 APES 涂层的载玻片上
• 切片平整度、粘附质量直接影响染色效果

3. 脱蜡与复水

• 二甲苯脱蜡 → 梯度乙醇（100% → 95% → 70%）复水 → PBS 洗涤
• 脱蜡不全是 IHC 失败的常见原因之一，会导致染色不均匀和背景增高

4. 抗原修复

• 热修复：切片浸入柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）或 Tris-EDTA（pH 9.0）中，微波/高压/水浴加热
• 酶修复：0.05%-0.1% 胰酶或蛋白酶 K 处理，适用于部分对抗原修复敏感的组织

5. 内源性酶灭活与封闭

• 3% H₂O₂ 处理 10-15 分钟，灭活内源性过氧化物酶（使用 HRP 系统时）
• 正常血清（同二抗种属）或 3% BSA 封闭非特异性结合位点，降低背景

6. 一抗孵育

• 优选单克隆抗体（特异性高），也可用多克隆抗体（灵敏度高）
• 孵育条件：4℃ 过夜（最常用）或 37℃ 1-2 小时
• 需对每种抗体进行稀释度优化（滴定实验）

7. 二抗孵育与检测

• 辣根过氧化物酶（HRP）聚合物标记二抗，孵育 30-60 分钟
• DAB 显色 3-10 分钟，显微镜下观察棕色信号出现即终止

8. 复染、脱水与封片

• 苏木精复染细胞核（提供形态学背景），盐酸乙醇分化，氨水返蓝
• 梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树脂封片

9. 结果判读与质量控制

• 每次实验必须设置阳性对照（已知表达靶抗原的阳性组织）和阴性对照（省略一抗或用同型无关 IgG）
• 评估染色强度（阴性、弱+、中++、强+++）和阳性细胞百分比
• 记录染色定位（细胞核、细胞质、细胞膜）

三、应用场景

3.1 感染性疾病诊断

IHC 在感染性疾病诊断中的核心价值在于能在组织原位直接显示病原体抗原，尤其适用于以下情形[2]：

• 难以培养的病原体：如 Coxiella burnetii（Q 热立克次体）、Tropheryma whipplei（惠普尔病）、Bartonella 属、Mycobacterium leprae（麻风分枝杆菌）等
• 培养周期过长的病原体：如 Mycobacterium tuberculosis（结核分枝杆菌），传统培养需 4-8 周
• 已接受经验性抗生素治疗：培养阴性但仍有组织病理改变的患者
• 病毒性感染：IHC 可检测 HBV、HCV、CMV、EBV、SARS-CoV-2、HIV 等病毒抗原在组织中的分布[2,6]
• 新发突发传染病：IHC 在 SARS、COVID-19 等新发传染病的病理研究中发挥了关键作用，CDC 的传染病病理学分支（IDPB）将 IHC 作为标准病原检测方法之一[6]

3.2 肿瘤病理诊断

IHC 在肿瘤病理中应用最为广泛[7]：

• 肿瘤分类与分型：通过 CK7/CK20、TTF-1、CDX2、GATA3 等标志物确定原发灶不明的转移性肿瘤的组织起源
• 预后判断：Ki-67 增殖指数、HER2 状态、p53 突变型表达等
• 治疗指导：ER/PR（乳腺癌内分泌治疗）、PD-L1（免疫检查点抑制剂）、ALK（靶向治疗）
• 微小残留病灶检测：通过特异性肿瘤标志物 IHC 检测淋巴结或切缘中的微转移灶

3.3 神经退行性疾病

IHC 可检测 α-突触核蛋白（帕金森病）、Tau 蛋白和 β-淀粉样蛋白（阿尔茨海默病）、TDP-43 等异常蛋白沉积，是神经病理诊断的金标准[1]。

3.4 移植病理

IHC 用于评估移植肾/心脏/肝的 C4d 沉积（抗体介导排斥反应标志物）、CD3/CD20 阳性的 T/B 细胞浸润分型等[1]。

四、优缺点

优势

1. 原位定位：能在完整的组织微环境中显示抗原的精确位置和分布模式，这是分子方法无法替代的解剖学信息[1]
2. 形态-分子相关性：可在 H&E 观察的组织学改变对应的同一区域直接检测蛋白表达，实现形态与功能关联
3. 灵敏度高：间接法结合信号放大系统，可检测低丰度的蛋白表达
4. 标本兼容性好：适用于 FFPE 组织（病理档案标本），也适用于细胞学标本和组织芯片
5. 操作便捷：常规病理实验室即可开展，无需昂贵的流式细胞仪或质谱设备
6. 通量灵活：既可单片手工染色，也可用自动染色仪进行大批量标准化染色

局限性

1. 定量能力有限：传统 IHC 为半定量方法（染色强度分级 + 阳性率评估），不同实验室间判读标准存在差异[1]
2. 抗体依赖性：结果高度依赖抗体的特异性和亲和力，不同批次抗体间可能存在变异
3. 抗原遮蔽：福尔马林固定引起的抗原交联可能导致假阴性，需抗原修复优化
4. 交叉反应：多克隆抗体易与其他抗原发生交叉反应，导致非特异性染色
5. 多重检测受限：传统 IHC 一般仅能同时检测 1-2 个指标，多重 IHC（≥4 色）技术要求较高
6. 判读主观性：染色结果的解读依赖病理医师的经验，不同观察者间存在判读差异

五、报告解读

IHC 结果的正确解读需综合考虑以下维度[1,4]：

染色定位：同一抗原在不同组织或疾病中的阳性信号可能分布于不同亚细胞结构。例如，β-catenin 在正常腺上皮呈膜表达，而在结直肠癌中若出现核表达则提示 Wnt 通路异常激活。病理报告中必须记录阳性信号的具体定位（细胞核/细胞质/细胞膜/细胞外基质）。

染色强度与分布：通常采用半定量评分系统。以乳腺癌 ER 检测的 Allred 评分为例，将阳性细胞比例（0-5 分）与染色强度（0-3 分）相加，总分 0-8 分，≥3 分为阳性。其他常用评分系统包括 H-score、IRS（Immunoreactive Score）等。

质量控制：每批 IHC 检测必须同时设阳性对照组织（确认抗体工作正常）和阴性对照/同型对照（排除非特异性染色）。内部阳性对照（如正常组织中已知表达该抗原的细胞）也是重要的质量监控指标[4]。

判读陷阱： - 边缘效应（组织边缘强化假阳性） - 坏死区域非特异性着色 - 内源性色素干扰（黑色素、含铁血黄素、脂褐素） - 内源性生物素活性（肝脏、肾脏组织中较高）

数字化病理：全切片扫描（Whole Slide Imaging）结合人工智能辅助判读，正在逐步解决 IHC 判读主观性和半定量精度不足的问题。目前已有多款基于深度学习的 IHC 自动评分软件获批用于临床（如 HER2、PD-L1、Ki-67 定量分析）[1]。

参考文献

[1] Mebratie DY, Dagnaw GG. Review of immunohistochemistry techniques: Applications, current status, and future perspectives[J]. Seminars in Diagnostic Pathology, 2024, 41(3): 154-160. DOI: 10.1053/j.semdp.2024.05.001.

[2] Oumarou Hama H, Aboudharam G, Barbieri R, et al. Immunohistochemical diagnosis of human infectious diseases: a review[J]. Diagnostic Pathology, 2022, 17: 17. DOI: 10.1186/s13000-022-01197-5.

[3] Anderson J, Rolls G, Westra S. 免疫组化：改善 IHC 染色的概述 + 步骤[EB/OL]. Leica Biosystems, 2022. https://www.leicabiosystems.com/zh/knowledge-pathway/immunohistochemistry-an-overview-steps-to-better-ihc-staining.

[4] Cell Signaling Technology. Immunohistochemistry (IHC) Overview[EB/OL]. https://www.cellsignal.com/learn-and-support/overview-of-ihc.

[5] Shi SR, Key ME, Kalra KL. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections[J]. Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 1991, 39(6): 741-748. DOI: 10.1177/39.6.1709656.

[6] Bhatnagar J, Gary J, Reagan-Steiner S, et al. Detection of SARS-CoV-2 in neonatal autopsy tissues and placenta[J]. Emerging Infectious Diseases, 2022, 28(3): 573-582. DOI: 10.3201/eid2803.211735.

[7] Crescenzi A, Baloch Z. Immunohistochemistry in the pathologic diagnosis and management of thyroid neoplasms[J]. Frontiers in Endocrinology, 2023, 14: 1194117. DOI: 10.3389/fendo.2023.1194117.

[8] Sigma-Aldrich/Merck. 诊断性免疫组化操作步骤[EB/OL]. https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/applications/clinical-testing-and-diagnostics-manufacturing/diagnostic-immunohistochemistry.

[9] CDC. Clinical Testing and Diagnosis for Powassan Virus Disease[EB/OL]. 2025-11-19. https://www.cdc.gov/powassan/hcp/diagnosis-testing/index.html.

[10] Coons AH, Creech HJ, Jones RN. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group[J]. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 1941, 47(2): 200-202. DOI: 10.3181/00379727-47-13084P.