【检测技术科普】2026-07-19 MIC 测定（微量肉汤稀释法）详解

概述

最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）是指在特定孵育条件下，能够抑制受试微生物肉眼可见生长的最低抗菌药物浓度。MIC 测定是抗菌药物敏感性试验（Antimicrobial Susceptibility Testing，AST）的核心方法之一，其结果直接指导临床个体化抗感染治疗用药，并为耐药性监测提供定量数据。

微量肉汤稀释法（Broth Microdilution，BMD）是 MIC 测定的参考标准方法，由美国临床和实验室标准协会（CLSI）在 M07 标准文件中系统规范，亦得到欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）的全面推荐[1-2]。与琼脂稀释法和肉汤宏量稀释法相比，微量肉汤稀释法使用 96 孔微量滴定板，具有操作标准化、通量高、耗材少、结果可重复性强等优势，被 WHO 推荐为耐药性监测的标准方法[3]。

一、原理

微量肉汤稀释法的基本原理是将受试菌株接种于含系列倍比稀释抗菌药物的液体培养基中，经标准条件孵育后，通过肉眼或仪器判断菌株在不同药物浓度下的生长情况。

核心逻辑链：将抗菌药物按浓度梯度（通常为 2 倍倍比稀释）预先加入 96 孔板的各孔中 → 每孔加入标准化菌悬液 → 孵育后观察孔内浊度变化 → 记录能完全抑制肉眼可见生长的最低药物浓度，即为 MIC 值[4]。

MIC 值的读取依据如下判定标准：

• MIC ≤ X µg/mL：当所有浓度孔均无菌生长时，报告 MIC ≤ 所测最低浓度
• MIC = X µg/mL：出现清晰可辨的生长抑制终点
• MIC > X µg/mL：当最高浓度孔仍有肉眼可见生长时，报告 MIC > 所测最高浓度

生长对照孔（无药物）必须显示明显浊度，以证实验证菌株活力充足；阴性对照孔（仅含培养基）必须保持澄清，以排除污染[1]。

EUCAST 基于 MIC 值与临床折点的比较，将菌株划分为三个类别：S（Susceptible，标准暴露方案敏感）、I（Susceptible, increased exposure，增加暴露方案敏感，2019 年由原"中介"重新定义）、R（Resistant，耐药）[5-6]。此外，流行病学界值（ECOFF）用于区分野生型与非野生型菌株群体，是耐药性监测的重要工具[7]。

二、操作流程

2.1 培养基准备

标准培养基为 阳离子调节的 Mueller-Hinton 肉汤（Cation-Adjusted Mueller-Hinton Broth, CAMHB）。CAMHB 中钙离子浓度需控制在 50–90 mg/L，镁离子浓度控制在 20–40 mg/L，以保证二价阳离子水平在不同批次间一致，避免影响抗菌药物（尤其是氨基糖苷类和四环素类）的体外活性[1]。

对于特殊菌种，培养基需进行调整： - 苛养菌（如链球菌属）：CAMHB + 5% 裂解马血（lysed horse blood）及 β-NAD（20 mg/L）[1] - 厌氧菌：布氏肉汤（Brucella broth）+ 维生素 K₁ + 血红素（CLSI M11）[8] - 真菌：RPMI-1640 培养基（含 L-谷氨酰胺，不含碳酸氢钠）（CLSI M27/M38）[9] - 头孢地尔（cefiderocol）检测：铁耗竭 CAMHB（Iron-depleted CAMHB）[1]

2.2 抗菌药物系列稀释

将抗菌药物标准品粉末（已知效价）溶解于适宜溶剂中制备储备液，浓度通常为 1,000–5,120 µg/mL，分装后 −70°C 或 −20°C 冻存备用[4]。

使用 CAMHB 对储备液进行 2 倍倍比稀释，最终在微量滴定板孔内形成系列浓度梯度。典型浓度范围为 0.015–256 µg/mL（具体范围视药物与受试菌组合而定）。稀释精度直接影响 MIC 结果：一步稀释误差可导致 MIC 值偏移 1 个对倍稀释度（即 2 倍误差）[1]。

2.3 菌悬液制备

1. 从纯培养平板上挑取 3–5 个形态相似的独立菌落
2. 悬浮于无菌生理盐水或肉汤中，调节浊度至 0.5 McFarland 标准（约 1–2 × 10⁸ CFU/mL）[10]
3. 在 15 分钟内将 0.5 McFarland 菌悬液于 CAMHB 中进一步稀释，使最终接种量达到 5 × 10⁵ CFU/孔（一般稀释比例为 1:100–1:200，取决于具体方案）[1]

每批实验需进行接种物菌落计数（colony count）以验证最终接种量是否符合 5 × 10⁵ CFU/孔的目标范围（CLSI 要求范围为 3–7 × 10⁵ CFU/孔）[1]。

2.4 加样与孵育

• 使用多道移液器（8 或 12 通道）向已含抗菌药物稀释液的 96 孔板各孔中加入等体积的标准化菌悬液
• 设置生长对照孔（含菌悬液 + 培养基，无抗菌药物）
• 设置阴性对照孔（仅含培养基，无菌悬液）
• 设置质控菌株孔（已知 MIC 范围的 ATCC 标准菌株）
• 每孔终体积通常为 100 µL 或 200 µL

孵育条件： - 非苛养需氧菌：35°C ± 2°C，大气环境，16–20 小时 - 苛养菌：35°C ± 2°C，5% CO₂ 环境，20–24 小时 - 厌氧菌：35°C ± 2°C，厌氧环境，48 小时[1,8]

2.5 结果判定

孵育结束后，将微量板置于 读数镜（plate-reading mirror）上，在白色背景光下肉眼判读各孔浊度：

• 生长阳性：孔底出现明显菌苔沉淀或肉汤混浊（沉淀直径 ≥ 1 mm 视为阳性）
• 生长阴性：肉汤澄清、孔底无可见菌苔沉淀

MIC 定义为能完全抑制肉眼可见生长的最低药物浓度孔（即该孔与更高浓度各孔均澄清、无沉淀）[1]。

若出现跳孔生长（skipping phenomenon，即高浓度孔生长而低浓度孔不生长），可能提示菌株异质性耐药或污染，应复查确认[11]。

三、应用场景

3.1 临床个体化治疗

对于以下临床场景，MIC 测定（而非单纯纸片法 S/I/R 分类）尤为重要： - 重症感染（脓毒症、感染性心内膜炎、骨髓炎）：精确 MIC 值指导剂量优化 - 耐药菌感染（MRSA、VRE、CRE、MDR-AB）：明确耐药程度，指导联合用药 - 深部真菌感染：侵袭性念珠菌病、曲霉病（参考 CLSI M27/M38 或 EUCAST E.Def 方案）[9] - 特殊解剖部位感染（中枢神经系统感染、骨关节感染）：需考虑药物组织穿透性的剂量设计

3.2 耐药性监测

全球耐药性监测网络（如 WHO GLASS、中国 CARSS、美国 NHSN、欧洲 EARS-Net）均以 MIC 测定（微量肉汤稀释法）为参考方法，确保各国监测数据的可比性[3,12]。中国细菌耐药性监测网（CHINET）亦主要参照 CLSI 折点标准进行 MIC 测定和耐药率汇总。

3.3 新药研发与药效学评价

• 新抗菌化合物的体外活性筛选（MIC₅₀ / MIC₉₀）
• 抗菌药物药代动力学/药效学（PK/PD）靶值确定（如 fAUC/MIC 和 fT>MIC 靶值推导）
• 联合药敏试验（棋盘微量稀释法，Checkboard BMD）评价协同、相加或拮抗效应

3.4 食品微生物与益生菌安全性评价

对益生菌制品中的乳酸菌、双歧杆菌等进行 MIC 测定，评估其获得性耐药基因转移风险（欧洲食品安全局 EFSA 指南推荐）[13]。

四、优缺点

优点

局限性

与其他方法的比较：Etest 易于操作且可检出异质性耐药，但与 BMD 相比可能存在系统性偏差（平均高 1–2 个对倍稀释度）；纸片扩散法简便经济、灵活性高，但仅提供 S/I/R 定性结果，无法获得精确 MIC 值（EUCAST 虽可从抑菌圈直径推导 MIC，精度有限）[14-15]。

五、报告解读

5.1 MIC 值的标准化报告

MIC 值以 µg/mL 为单位报告。示例： - 某株金黄色葡萄球菌对苯唑西林的 MIC = 0.5 µg/mL - 某株大肠埃希菌对美罗培南的 MIC = 0.03 µg/mL

5.2 临床折点分类

将 MIC 值与 CLSI 或 EUCAST 公布的临床折点（clinical breakpoints）比较：

⚠️ 重要提示：MIC 值的解读必须基于最近版本折点标准（CLSI M100 或 EUCAST Breakpoint Table），因为折点会随证据更新而调整。CLSI 与 EUCAST 折点并非总是等同——某些情况下同一 MIC 值在不同体系下可被归入不同类别[7,16]。

5.3 流行病学界值（ECOFF）

ECOFF 区分野生型（WT）与非野生型（NWT）菌株群体，主要用于流行病学监测而非个体临床决策。ECOFF 通常服从双峰分布，以 MIC 分布的 95–99% 临界值为界点[7]。

5.4 质控标准

每次检测必须包括 ATCC 标准质控菌株，其 MIC 值必须在已知可接受范围内： - 大肠埃希菌 ATCC 25922 - 金黄色葡萄球菌 ATCC 29213 - 铜绿假单胞菌 ATCC 27853 - 粪肠球菌 ATCC 29212

若质控菌株 MIC 超出可接受范围，整批结果无效，必须重做[1,4]。

5.5 需要注意的陷阱

1. 跳孔现象：高浓度长菌而低浓度不长，需重做或怀疑异质性耐药
2. 拖尾终点：药液颜色与生长浊度不易区分，需仔细辨认
3. 污染：阴性对照孔出现浊度提示操作污染
4. 接种量偏差：接种量过高会导致 MIC 假性升高，过低则假性降低——验证 colony count 的重要性
5. 跨实验室比较：不同实验室使用不同标准体系（CLSI vs EUCAST）时，MIC 值可比但分类可能不同

参考文献

[1] Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically[S]. 12th ed. CLSI standard M07. Wayne, PA: CLSI, 2024.

[2] European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. EUCAST reading guide for broth microdilution, version 4.0[EB/OL]. Växjö: EUCAST, 2024. https://www.eucast.org/ast_of_bacteria/mic_determination.

[3] World Health Organization. Global antimicrobial resistance surveillance system (GLASS): molecular methods for antimicrobial resistance (AMR) diagnostics to enhance the global antimicrobial resistance surveillance system[EB/OL]. Geneva: WHO, 2021. https://www.who.int/publications/i/item/9789240026605.

[4] Kowalska-Krochmal B, Dudek-Wicher R. The minimum inhibitory concentration of antibiotics: methods, interpretation, clinical relevance[J]. Pathogens, 2021, 10(2): 165. DOI: 10.3390/pathogens10020165.

[5] Aupaix A, Mzougui S, Soleimani R. Impact of susceptible, increased exposure, a new definition of the former intermediate susceptibility category, introduced by the European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing on antimicrobial susceptibility testing evaluation[J]. Clin Microbiol Infect, 2024, 30(12): 1494-1496. DOI: 10.1016/j.cmi.2024.07.010.

[6] Van den Broucke E, Quintens C, Peetermans W E, et al. Antimicrobial stewardship strategies for implementing the 2019 EUCAST "I" definition[J]. BMC Infect Dis, 2025, 25: 1181. DOI: 10.1186/s12879-025-11943-x.

[7] Kahlmeter G, Brown D F J, Goldstein F W, et al. European harmonization of MIC breakpoints for antimicrobial susceptibility testing of bacteria[J]. J Antimicrob Chemother, 2003, 52(2): 145-148. DOI: 10.1093/jac/dkg312.

[8] Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for antimicrobial susceptibility testing of anaerobic bacteria[S]. 9th ed. CLSI standard M11. Wayne, PA: CLSI, 2018.

[9] Clinical and Laboratory Standards Institute. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts[S]. 4th ed. CLSI standard M27. Wayne, PA: CLSI, 2017.

[10] Arendrup M C, Meletiadis J, Guinea J, et al. How to interpret MICs of antifungal compounds according to the revised clinical breakpoints v. 10.0 European committee on antimicrobial susceptibility testing (EUCAST)[J]. Clin Microbiol Infect, 2020, 26(11): 1464-1472. DOI: 10.1016/j.cmi.2020.06.007.

[11] Turnidge J D, Ferraro M J, Jorgensen J H. Susceptibility test methods: general considerations[M]//Jorgensen J H, Pfaller M A, Carroll K C, et al. Manual of clinical microbiology. 11th ed. Washington, DC: ASM Press, 2015: 1246-1274.

[12] 国家卫生健康委员会. 中国抗菌药物耐药性监测报告[R]. 北京: 国家卫生健康委员会, 2019-2024.

[13] European Food Safety Authority. Guidance on the characterisation of microorganisms used as feed additives or as production organisms[J]. EFSA J, 2018, 16(3): 5206. DOI: 10.2903/j.efsa.2018.5206.

[14] Domig K J, Mayrhofer S, Zitz U, et al. Comparison of broth microdilution, Etest, and agar disk diffusion methods for antimicrobial susceptibility testing of Lactobacillus acidophilus group members[J]. J Clin Microbiol, 2008, 46(6): 2061-2067. DOI: 10.1128/JCM.00084-08.

[15] Kolesnik-Goldmann N, Seth-Smith H M B, Haldimann K, et al. Comparison of disk diffusion, E-test, and broth microdilution methods for testing in vitro activity of cefiderocol in Acinetobacter baumannii[J]. Antibiotics, 2023, 12(7): 1212. DOI: 10.3390/antibiotics12071212.

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