【检测技术科普】2026-07-26 中和试验详解

概述

中和试验（Neutralization Test, NT）是病毒血清学检测中的经典方法，通过检测待检血清中的中和抗体（neutralizing antibodies, NAbs）是否能够抑制病毒的感染性，从而评估机体的免疫保护水平。中和抗体的本质是特异性免疫球蛋白，能够与病毒表面抗原结合，阻断病毒吸附和进入宿主细胞的过程[1]。中和试验因兼具高敏感性和高特异性，被广泛认为是评估抗病毒免疫应答的"金标准"[2]。自20世纪30年代首次用于黄热病病毒的中和抗体检测以来，这一技术经历了从体内动物实验到体外细胞培养、再到高通量自动化检测的持续演进[3]。

一、原理

中和试验的核心原理基于抗原-抗体特异性结合后对病毒感染力的中和效应。将待测血清（含或不含特异性抗体）与定量活病毒在体外适宜条件下共同孵育，使抗体与病毒表面抗原表位结合。如果血清中存在足够滴度的中和抗体，病毒表面的关键受体结合位点被封闭，病毒将无法吸附并进入易感宿主细胞。随后将混合物接种至敏感的宿主系统（细胞培养、鸡胚或实验动物），通过测定残存病毒感染力的程度来判定中和抗体的存在和水平[1][4]。

中和抗体滴度通常以能抑制50%病毒感染的血清最高稀释度（ND₅₀或IC₅₀）表示。根据具体操作模式，中和试验可分为两大类：

1. 固定病毒-稀释血清法（常量法）：将等量标准病毒液（通常为100 CCID₅₀/0.1 mL）与不同稀释度的待测血清混合孵育后接种宿主系统，计算能使50%培养孔不出现细胞病变效应的血清最高稀释倍数[5]。

2. 固定血清-稀释病毒法：将不同稀释度的病毒液分别与等量标准抗血清和阴性血清混合，计算实验组与对照组的感染滴度对数差，以中和指数（Neutralization Index, NI）表示中和能力[1]。

目前已发展出多种技术平台的中和试验方法，包括传统的蚀斑减少中和试验（Plaque Reduction Neutralization Test, PRNT）、微量中和试验（Microneutralization Assay, MNA）、假病毒中和试验（Pseudotype Virus Neutralization Assay, PVNA）以及替代病毒中和试验（Surrogate Virus Neutralization Test, sVNT）[4][6]。

二、操作流程

2.1 蚀斑减少中和试验（PRNT）

PRNT是最经典的和试验方法，被WHO推荐为黄病毒（如登革病毒、黄热病毒）中和抗体检测的参考标准[7]。标准操作步骤如下：

步骤1：样本准备。收集患者血清或血浆，经56℃、30分钟热灭活补体，离心去除沉淀。

步骤2：血清稀释。用细胞维持液对血清进行连续2倍系列稀释（通常从1:10开始至1:1280或更高），设置阳性对照（已知中和抗体阳性血清）、阴性对照（健康人血清）和病毒对照（无血清的病毒液）[7]。

步骤3：病毒-血清中和。将等体积（通常各50-100 μL）的标准工作病毒液（含100-200 PFU/孔）与各稀释度血清混合，置37℃水浴或CO₂孵箱中和1小时。

步骤4：接种细胞。将中和混合物接种至已长成单层的易感细胞（如Vero E6细胞）培养板中，37℃吸附1-2小时，期间轻摇使吸附均匀。

步骤5：覆盖半固体培养基。去除接种物后加入含甲基纤维素或琼脂糖的营养覆盖层，继续培养至蚀斑形成（通常2-10天，取决于病毒种类）[4][7]。

步骤6：固定与染色。用甲醛固定细胞层，结晶紫或中性红染色，计数蚀斑数。

步骤7：结果计算。以能使蚀斑数减少≥90%（PRNT₉₀）或≥50%（PRNT₅₀）的最高血清稀释倍数报告中和抗体滴度[7]。

2.2 微量中和试验（MNA）

MNA使用96孔微量培养板替代传统培养瓶，将等量标准病毒液（100 CCID₅₀）与连续倍比稀释的血清中和后接种细胞单层，以细胞病变效应（Cytopathic Effect, CPE）作为观察终点[5]。该法适合大规模样本筛查和疫苗临床试验中的免疫原性评价，试验周期通常为3-7天。SARS-CoV-2疫情期间，基于MNA的WHO国际标准品（20/136）被广泛用于不同实验室间结果的校准与比对[3][6]。

2.3 替代病毒中和试验（sVNT）

sVNT基于ELISA竞争抑制原理，无需使用活病毒和细胞培养。将待测血清与标记的病毒受体结合域（Receptor Binding Domain, RBD）蛋白预孵育，再加入包被了血管紧张素转化酶2（ACE2）受体的微孔板。血清中的中和抗体与RBD结合后将阻断RBD-ACE2的相互作用，显色信号的降低程度即反映中和抗体水平[8]。该法在生物安全二级（BSL-2）实验室即可操作，2-4小时可出结果，特别适合资源有限的实验室。

三、应用场景

中和试验的临床应用涵盖感染性疾病诊断、疫苗免疫原性评价、治疗性抗体筛选及流行病学监测等多个领域。

1. 病毒性疾病诊断：中和试验可用于急性期与恢复期配对血清的抗体效价测定，4倍及以上升高具有诊断意义。对某些不能用分子诊断直接检测的病毒（如无法培养的病毒）或病毒血症窗口已过的患者，中和抗体检测提供回顾性诊断依据[1]。

2. 疫苗免疫原性评价：中和抗体滴度是评价疫苗保护效力的主要免疫学替代终点。WHO已发布SARS-CoV-2抗体的国际标准品（NIBSC 20/136），为不同疫苗平台间的免疫应答比较提供了统一的计量单位（国际单位/毫升, IU/mL）[3][6]。

3. 自然感染与疫苗免疫的鉴别：通过检测针对非结构蛋白（如SARS-CoV-2的N蛋白）的中和抗体，可区分自然感染诱导的免疫应答与仅含S蛋白的mRNA疫苗诱导的免疫应答[6]。

4. 免疫保护阈值研究：中和试验结果被用于确定"保护性抗体阈值"（correlate of protection）。例如，WHO基于PRNT₅₀滴度≥1:10作为黄热病疫苗免疫成功的保护阈值[7]。

5. 病原体抗原变异监测：利用已知血清型特异性抗血清和新分离病毒株进行交叉中和试验，可监测病毒的抗原漂移和免疫逃逸能力。

6. 血源制品筛查：对恢复期血浆、高效价免疫球蛋白制品的功能性中和活性进行批间一致性评估[6]。

四、优缺点

4.1 优点

• 高敏感性和高特异性：中和抗体针对病毒功能性抗原表位，与保护性免疫直接相关，假阳性率低[1][2]。
• 功能相关性：直接检测抗体的病毒中和活性，而不仅是结合活性，更能反映真实免疫功能状态。
• 临床相关性高：中和抗体滴度与免疫保护水平具有明确量效关系，被多类疫苗上市后有效性监测作为参考标准[7]。
• 结果可定量：可精确定量中和抗体滴度（IC₅₀、ND₅₀等），适合纵向监测和比较研究[6]。

4.2 缺点

• 操作复杂、周期长：传统PRNT需要培养活病毒和细胞，标准操作周期3-14天，无法满足临床快速诊断需求[4][5]。
• 生物安全要求高：使用活病毒需要在相应生物安全级别（BSL-2/BSL-3）实验室操作，限制了应用范围。
• 标准化困难：各实验室使用的病毒株、细胞系、孵育条件等差异较大，不同实验室间的结果难以直接比较[6]。
• 通量有限：传统蚀斑计数法手工操作、劳动强度大，不适合大规模流行病学调查。
• 无法区分亚型交叉反应：同属不同血清型的病毒（如登革病毒四种血清型）间存在交叉中和反应，增加血清型特异性判断的难度[2][7]。

五、报告解读

5.1 结果报告方式

中和试验结果通常以血清稀释度的倒数表示，如PRNT₅₀滴度1:40、MNA ND₅₀滴度≥1:160等。当使用了WHO国际标准品进行校准时，应进一步以IU/mL报告[3][6]。

5.2 判定标准

• 阳性/阴性判定：以临界稀释度（通常为1:10或1:20）为截断值，高于此值为阳性。
• 配对血清诊断：急性期与恢复期血清同时检测，恢复期抗体滴度较急性期升高≥4倍有确诊意义[1]。
• 疫苗保护阈值：不同疫苗和病原体具有不同的保护阈值，如黄热病疫苗PRNT₅₀≥1:10被视为免疫成功[7]。
• 几何平均滴度（GMT）：多组间比较时，将各标本滴度取对数后计算均值，再转换为几何平均值以符合正态分布假设。

5.3 干扰因素

• 补体系统：未灭活补体的血清可能增强或抑制中和效果，因此建议热灭活标准化处理。
• 血清毒性：部分血清样本对细胞具有非特异性毒性，应设置细胞毒性对照排除假阳性。
• 交叉反应：同一病毒属的不同血清型/基因型间存在交叉中和反应，应使用同型标准株和标准血清进行验证[2][7]。
• 标本处理：反复冻融、溶血、脂血标本可降低抗体活性，影响检测结果。

参考文献

[1] 周晓光, 李琦涵, 段招军, 等. 医学病毒学检验[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2020.

[2] Roehrig J T, Hombach J, Barrett A D T. Guidelines for plaque-reduction neutralization testing of human antibodies to dengue viruses[J]. Viral Immunology, 2008, 21(2): 123-132. DOI: 10.1089/vim.2008.0007.

[3] Mattiuzzo G, Knezevic I, Hassall M, et al. WHO international standard for SARS-CoV-2 antibodies to determine markers of protection[J]. The Lancet Microbe, 2022, 3(2): e81-e82. DOI: 10.1016/S2666-5247(21)00307-4.

[4] Bewley K R, Coombes N S, Gagnon L, et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by wild-type plaque reduction neutralization, microneutralization and pseudotyped virus neutralization assays[J]. Nature Protocols, 2021, 16(6): 3114-3140. DOI: 10.1038/s41596-021-00536-y.

[5] Sun Y, Liu B, Zheng L, et al. SARS-CoV-2 neutralization assays used in clinical trials: a narrative review[J]. Vaccines, 2024, 12(5): 554. DOI: 10.3390/vaccines12050554.

[6] Fan X L, Li Z L, Zhao J, et al. Overview of neutralization assays and international standard for detecting SARS-CoV-2 neutralizing antibody[J]. Viruses, 2022, 14(7): 1557. DOI: 10.3390/v14071557.

[7] World Health Organization. Guidelines for plaque-reduction neutralization testing of human antibodies to dengue viruses[S]. Geneva: WHO, 2007. WHO/IVB/07.07.

[8] Tan C W, Chia W N, Qin X, et al. A SARS-CoV-2 surrogate virus neutralization test based on antibody-mediated blockage of ACE2-spike protein-protein interaction[J]. Nature Biotechnology, 2020, 38(9): 1073-1078. DOI: 10.1038/s41587-020-0631-z.