【检测技术科普】2026-08-02 蛋白免疫印迹（Western Blot）详解——从 Towbin 1979 到 CDC 2014 算法更新

概述

蛋白免疫印迹（Western Blot，简称 WB），又称免疫印迹（immunoblotting），是分子生物学、生物化学与免疫学中应用最广泛的蛋白分析技术之一。其核心思路是「先用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）按分子量分离蛋白，再把分离后的蛋白电转移到固相膜上，最后用特异性抗体去识别目标蛋白」[1]。技术体系集 SDS-PAGE 的高分辨力与固相免疫测定的高特异性、高灵敏度于一体，是几乎所有研究蛋白表达、翻译后修饰、蛋白-蛋白相互作用论文的「标配实验」[1,2]。

2026 年距离 W. Neal Burnette 在 1981 年首次提出「Western blot」一词已 45 年[1,3]。然而对临床实验室来说，WB 的角色正在发生深刻变化：2014 年 6 月，美国 CDC 在新版《HIV 实验室检测算法》中正式将 HIV-1 Western blot 从「确诊试验」列表中移出[4,5]，标志着这一曾经被誉为「HIV 确诊金标准」的技术让位给更快速、更客观的免疫抗原/抗体联合检测与核酸检测。本文将以 NCBI Bookshelf StatPearls 文献[1]、CDC NHANES 实验室操作手册[6]、《Biochem Mol Biol Educ》综述[7]为主要权威依据，系统梳理 WB 的原理、操作、临床应用、报告解读与未来演进。

一、历史沿革：一场「印迹家族」的接力

WB 不是凭空出现的，它脱胎于 1970 年代核酸印迹技术（Southern blot 1975、Northern blot 1977）的成功[1]。

• 1970 年代初，W. M. Kelley 和 M. J. Bennett 最早将「电泳分离蛋白 + 抗体特异识别」组合，用于检测血清中的病毒抗原，奠定了 WB 雏形[2]。
• 1979 年，斯坦福大学的 Harry Towbin 等人首次系统描述了「SDS-PAGE 后将蛋白从凝胶转移到硝酸纤维素膜」的电转移方法，最初是为了研究呼吸道病毒[1,2]。这一改造直接借鉴 Southern/Northern blot，是 WB 走向工程化的关键一步。
• 1981 年，W. Neal Burnette 在《Analytical Biochemistry》发表的论文中，正式把这一方法命名为「Western blotting」，既遵循了「以发明人姓氏命名印迹」的学界传统（Southern→Edwin Southern、Northern→概念名），又凸显其对象为「蛋白」[1,3]。
• 1990 年代，化学发光（ECL）底物体系上市，将检测灵敏度比传统 DAB 比色法提升 1-2 个数量级，使 WB 真正具备「pg 级」检测能力。
• 2014 年 6 月，CDC 发布更新版 HIV 实验室检测推荐算法，明确将 HIV-1 Western blot 移出确诊试剂清单，推荐采用 HIV-1/2 抗原抗体联合检测试剂 + HIV-1/2 抗体鉴别试剂 +（必要时）HIV RNA 检测的新三步法[4,5]。
• 2020 年代至今，WB 与多重荧光二抗、数字成像系统、单细胞微流控芯片深度融合，朝着更高通量、更精确定量、更小样本需求的方向演进[2]。

二、基本原理：四个相互锁扣的分子过程

WB 的技术原理建立在四个相互关联的物理化学与分子识别过程之上[1,2]：

1. 蛋白解聚与分子量分离：十二烷基硫酸钠（SDS）作为阴离子去垢剂，结合蛋白疏水区并破坏其高级结构；β-巯基乙醇作为还原剂，切断二硫键。两者联合作用使蛋白带上均匀负电荷，形成「SDS-蛋白复合物」。在 PAGE 不连续缓冲系统中，这一复合物仅按分子量大小迁移，从而使「分子量 marker」成为精确参照[1]。
2. 电转印的物理化学：电场驱动带负电的蛋白从凝胶（阴极侧）向阳极侧迁移，依次经过「海绵/滤纸/凝胶/PVDF 或 NC 膜/滤纸/海绵」的三明治结构，吸附到固相膜上。转印缓冲液中通常含 Tris-甘氨酸系统 + 适量甲醇（增强蛋白与膜的疏水结合），常用的湿转/半干转电流 200-400 mA、转印 30-90 min[1]。
3. 抗原-抗体特异性识别：膜上的蛋白与「一抗」结合。一抗的抗原表位分为两类： - 线性表位：对应变性蛋白（一抗识别的是氨基酸序列片段），可耐受 SDS 变性条件——这是常规 WB 模式； - 构象表位：依赖蛋白三维结构，需用非变性电泳（如 native PAGE）[1,2]。
4. 酶标二抗信号放大：酶标二抗（常用 HRP-标记，偶联于抗一抗 Fc 段的二抗）与底物反应。化学发光底物（ECL，luminol + H₂O₂ + 增强剂对碘苯酚）在 HRP 催化下氧化鲁米诺，释放 425 nm 波长的光子，增强剂可延长发光时间并使信号强度提升至传统显色法的 100-1000 倍[2]。

一句话总结：「SDS-PAGE 切开蛋白、电转移到膜、一抗绑靶、酶标二抗+底物发光」——四步缺一不可[1]。

三、操作流程（标准路线）

以下流程综合 NCBI Bookshelf StatPearls[1]、CDC NHANES Laboratory Procedure Manual[6] 及《Biochem Mol Biol Educ》综述[7] 等权威来源，描述一篇典型 WB 实验的标准路线：

3.1 样品制备

• 细胞样品：去培养基后用温 PBS 洗 2-3 次，加冰预冷裂解液（含蛋白酶抑制剂 cocktail），冰上裂解 10-20 min，刮下细胞，超声 100-200 W × 3 s × 2 次，4 ℃ 12000 g 离心 2 min，取上清[7]。
• 组织样品：心、肝、脾、肾等组织每 50-100 mg 加 1 mL 裂解液（肺组织 100-200 mg/mL），匀浆后同样离心取上清[7]。
• 蛋白定量：常用 BCA 法或 Bradford 法（Bradford 利用考马斯亮蓝 G-250 与蛋白结合后在 595 nm 处吸光度变化；BCA 利用 Cu²⁺ 被蛋白还原为 Cu⁺ 后与 BCA 螯合剂生成紫色络合物，562 nm 处读数）[1,2]。两者线性范围一般 20-2000 μg/mL。
• 上样缓冲液（Laemmli buffer）：60 mM Tris-HCl pH 6.8 + 20% 甘油 + 2% SDS + 4% β-巯基乙醇 + 0.01% 溴酚蓝——SDS 解聚蛋白、β-巯基乙醇断二硫键、甘油增密便于上样、溴酚蓝作为电泳前沿指示[1]。
• 变性：98 ℃ 加热 3 min，使蛋白彻底解聚；冷却后上样，或 -80 ℃ 冻存。

3.2 SDS-PAGE 电泳

不连续缓冲系统（Laemmli 系统）由「浓缩胶（stacking gel，pH 6.8，大孔）+ 分离胶（resolving gel，pH 8.8，小孔）」组成[1]。样品在浓缩胶中被压缩成一条窄带，进入分离胶后按分子量大小分开。常用浓度：10% 分离胶适用于 30-80 kDa 蛋白，12-15% 适用于 10-40 kDa 小蛋白。

3.3 转膜（电转移）

经典「湿转」流程[1,7]： 1. 准备转移缓冲液（Tris 5.8 g + 甘氨酸 2.9 g + SDS 0.37 g + 甲醇 200 mL + ddH₂O 定容至 1 L）； 2. PVDF 膜先在甲醇中浸泡 5-10 s 激活（NC 膜无需甲醇），再在转移缓冲液中平衡； 3. 按「负极→海绵→滤纸→凝胶→膜→滤纸→海绵→正极」顺序装配三明治，排出气泡； 4. 冰浴下 100 V 恒压转印 60-90 min（小蛋白缩短，大蛋白延长），或 4 ℃ 冷室过夜 30 V 恒压。

3.4 封闭与抗体孵育

• 封闭：5% 脱脂奶粉或 5% BSA（磷酸化研究必须用 BSA，避免奶粉中的酪蛋白干扰）溶于 TBST，室温 1 h，封闭膜上未被蛋白占据的非特异结合位点[1]。
• 一抗孵育：按厂家推荐比例稀释（通常 1:500-1:2000），4 ℃ 摇床过夜（12-16 h），TBST 洗膜 3 次 × 5 min。
• 酶标二抗孵育：HRP-标记二抗（1:5000-1:10000）室温 1 h，TBST 洗膜 3 次 × 5 min[1]。

3.5 信号检测与图像分析

• ECL 化学发光：将 ECL 工作液（A 液鲁米诺 + B 液过氧化氢）等体积混匀覆盖膜表面，避光反应 1-2 min 后置入数字成像系统（ChemiDoc / ImageQuant）曝光。
• 定量分析：用 ImageJ / Image Lab 等软件对目标条带做密度分析（densitometry），以「目标蛋白条带灰度 ÷ 内参蛋白（β-actin、GAPDH、α-tubulin 等）条带灰度」的比值进行相对定量[1]。
• Stripping & Reprobing：同一张膜可用 Stripping buffer（β-巯基乙醇 + SDS）洗脱一抗/二抗后，重新封闭 + 孵育其他抗体，实现「一张膜多种指标」。

四、应用场景：从基础研究到临床检测

WB 在医学中的应用可分为三大类[1]：

4.1 基础研究——验证基因表达

WB 是基因表达研究最常用的「翻译水平验证」手段。qPCR 检测 mRNA 表达上调后，WB 可在蛋白水平确认其产物是否真的增加；CRISPR 敲除细胞系构建后，WB 用于确认靶蛋白是否被敲低；信号通路研究（如 MAPK、PI3K-AKT-mTOR）通过 WB 检测磷酸化蛋白水平（p-ERK、p-AKT）评估通路激活状态[1,2]。

4.2 临床诊断——金标准地位正在转变

历史上，WB 最标志性的临床应用是 HIV-1 确诊试验。1985 年起，美国血库开始用 ELISA 初筛 + WB 复检的策略确认献血员 HIV 感染状态，WB 通过检测血清中针对 HIV 病毒不同抗原（gp160、gp120、gp41、p24、p31、p18 等）的多条带图谱判断阴阳性[4,6]。单一条带（如仅 p24）的「不确定（indeterminate）」结果很常见，需 6 个月后复查[6]。

CDC 2014 年的算法更新[4,5]主要驱动因素有三： 1. WB 操作复杂、判读主观（不同实验室对「阳性条带组合」判读存在差异），且有约 4-15% 的「indeterminate」结果率； 2. WB 结果需 7-14 天，延误治疗时间——中国 CDC 数据显示当时约 25% 的新诊断 HIV/AIDS 病例已是 AIDS 期[4]； 3. 新一代「HIV Ag/Ab 联合检测试剂（4 代 ELISA / 化学发光）」+「HIV-1/2 抗体鉴别试剂」+「HIV RNA」三步法可在 1-3 天内出结果，灵敏度更高、假阳性更低。

当前临床应用已退守至以下场景[1,2]： - 自身免疫性疾病的特异性抗体确认（如系统性红斑狼疮的抗 dsDNA、抗 Sm 抗体谱，部分医院仍以 WB/LINE-BLOT 形式报告）； - 神经退行性疾病生物标志物研究（如帕金森病的 α-synuclein 多聚体检测）； - 重组治疗蛋白的表达验证（如基因治疗产品 AAV 载体表达蛋白）； - HCV、HDV 等其他病原体特异性抗体谱确认（在资源有限地区仍使用）。

⚠️ 重要提示：StatPearls 明确指出「CDC no longer supports the use of the Western blot assay for diagnostic purposes」[1]。国内诊断领域也已全面转向化学发光/PCR，仅少数三甲医院仍保留 WB 作为疑难病例复核工具。

4.3 药物开发与生物制品质量控制

• 药物靶点验证：候选小分子药物处理细胞后，WB 检测下游通路蛋白及其磷酸化水平变化，验证「靶点-效应」关系；
• 生物类似药一致性评价：WB 比较候选药与原研药在糖基化、降解片段等方面的差异；
• AAV 基因治疗制品：WB 用于检测目的基因在患者细胞中的蛋白表达[1,2]。

五、优缺点：为何它仍是「标配」，又是为何在临床诊断中被取代

5.1 优点[1,7]

1. 同时给出分子量 + 相对表达量 + 翻译后修饰状态——单一实验信息量大；
2. 高特异性：抗原-抗体结合 + 分子量定位，双重维度降低假阳性；
3. 半定量能力：配合内参可粗略评估蛋白丰度变化；
4. 成熟度高：40 多年文献积累、试剂货架丰富、操作标准化。

5.2 缺点与局限[1,2,4]

1. 「半定量」而非真正定量：线性范围窄（一般一个数量级），需严格控制上样量；
2. 周期长：从样品制备到出结果通常 1-3 天，无法用于急诊；
3. 结果主观性强：条带判读依赖肉眼/图像软件判读，不同操作者/不同实验室间重现性差异显著[4]；
4. indeterminate 结果：WB HIV 检测有约 4-15% 不确定结果[6]，增加受检者焦虑；
5. 抗体依赖：商品抗体质量参差不齐，非特异结合导致「高背景」或「杂带」是常见痛点；
6. 样本量需求较大：通常需要 10-50 μg 总蛋白，对稀有样本（如临床穿刺活检组织）不友好。

六、报告解读：以 HIV-1 Western Blot 为例

虽然 2014 年后 CDC 已不推荐 WB 作 HIV 确诊试验[4,5]，但在全球很多地区（特别是资源有限地区、中国部分基层医院）以及自身免疫病诊断中仍在使用 WB/LINE-BLOT 类报告。报告解读要点[6]：

关键点：[6] **「A negative blot does not exclude the possibility of infection with HIV-1.」阴性结果不能完全排除 HIV 感染。

七、未来展望：从「单条带」到「多重定量 + 单细胞」

WB 自身也在进化[1,2]：

1. 多重荧光 Western Blot：使用不同波长（488 nm、555 nm、647 nm 等）荧光二抗，可在一张膜上同时检测 2-4 种目标蛋白，免去 Stripping 步骤；
2. 数字定量 WB（如 ProteinSimple Wes / Jess 系统）：「毛细管电泳 + 免疫检测」全自动体系，无需 SDS-PAGE 与转膜，CV < 10%，线性范围扩大至 3-4 个数量级，灵敏度可达 pg 级；
3. 单细胞 Western Blot（scWestern）：在微流控芯片上对单个细胞进行原位 WB，可用于细胞异质性研究（如肿瘤微环境、神经科学干细胞分化）；
4. AI 辅助图像分析：基于深度学习的条带自动识别与定量工具正在被 ImageJ、Image Lab 等软件集成，降低人为判读差异。

参考文献

1. Zubair M, Launico MV. Western Blot: Principles, Procedures, and Clinical Applications[M]//StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2025 Dec 1. PMID: 31194430. Bookshelf ID: NBK542290. DOI: 10.32388/HZMD9A. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK542290/

2. 上海陌孚医药科技有限公司. 蛋白免疫印迹（WB）原理与试剂趣谈[EB/OL]. 2026-01-15. https://www.med-life.cn/article/762.html

3. Burnette WN. Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A[J]. Analytical Biochemistry, 1981, 112(2): 195-203. DOI: 10.1016/0003-2697(81)90281-9.

4. Pang J, Saksena NK, Xie C, et al. Evaluation of Blood-Based Antibody Rapid Testing for HIV Early Therapy: A Meta-Analysis of the Evidence[J]. Frontiers in Microbiology, 2018, 9: 1455. DOI: 10.3389/fmicb.2018.01455. https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC6036269

5. Yale School of Medicine, Department of Medicine. New Diagnostic Algorithm for HIV: Farewell Western Blot[R/EB/OL]. New Haven: Yale; 2014. https://medicine.yale.edu/download-file/165c7ce8-af8d-4089-89e8-a360c9597ab5

6. U.S. Centers for Disease Control and Prevention, National Center for HIV/AIDS, Viral Hepatitis, STD, and TB Prevention, HIV Laboratory Branch. HIV 1 Antibody and Western Blot in Serum: NHANES 2013-2014 Laboratory Procedure Manual[R/OL]. Atlanta: CDC; 2007 (Revised). https://wwwn.cdc.gov/nchs/data/nhanes/public/2013/labmethods/HIV_H_MET_EIA_WB.pdf

7. Ghosh R, Gilda JE, Gomes AV. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots[J]. Biochemistry and Molecular Biology Education, 2014, 42(5): 412-422. DOI: 10.1002/bmb.20823.

8. U.S. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Provisional Public Health Service inter-agency recommendations for screening donated blood and plasma for antibody to the virus causing acquired immunodeficiency syndrome[J]. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report, 1985, 34(1): 5-7. https://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/00000322.htm

9. Mahmood T, Yang PC. Western blot: technique, theory, and trouble shooting[J]. North American Journal of Medical Sciences, 2012, 4(9): 429-434. DOI: 10.4103/1947-2714.100998.

本文是检测技术科普，覆盖 WB 原理、操作、临床应用（HIV/自身免疫/药物开发）、优缺点、报告解读与未来演进。供感染科、检验科、临床医学研究人员参考。文中数据已用 NCBI Bookshelf StatPearls、CDC NHANES、Frontiers in Microbiology 等权威来源交叉核验。如有错漏，欢迎指正。