【检测技术科普】2026-08-02 三代测序（Nanopore/PacBio）详解

概述

三代测序（third-generation sequencing，TGS）又称单分子测序（single-molecule sequencing），指不需要聚合酶链反应（PCR）扩增、直接对单个 DNA/RNA 分子进行测序的技术。与以 Illumina 为代表的二代测序（短读长、依赖扩增）不同，三代测序的核心特点是读长长（单条读长可达数十 kb 甚至 Mb 级）和无扩增偏倚，能够完整跨越重复区、高 GC 区与结构变异区域。

目前临床与科研中最具代表性的三代测序平台有两个：美国 Pacific Biosciences（PacBio）公司的单分子实时测序（single-molecule real-time，SMRT），以及英国 Oxford Nanopore Technologies（ONT）公司的纳米孔测序（nanopore sequencing）。两者均为长读长平台，但原理、准确率与通量特征差异显著（详见下文）。

在感染性疾病领域，三代测序的价值主要体现在四个方面：① 宏基因组测序（mNGS）直接对临床标本中的病原体进行无偏检测；② 耐药基因的快速预测；③ 16S rRNA 全长扩增子测序实现物种级细菌鉴定；④ 疫情暴发时的现场实时基因组监测。自 2015 年首次报道从临床样本中实时检出埃博拉病毒、基孔肯雅病毒与丙型肝炎病毒以来[1]，该技术已从科研探索逐步走向临床常规实验室[2,3]。

一、原理

1.1 PacBio SMRT 测序

SMRT 测序的核心是零模波导（zero-mode waveguide，ZMW）——一种纳米尺度的光波导微孔阵列。每个 ZMW 底部固定一个 DNA 聚合酶分子，荧光标记的 dNTP 在聚合酶掺入碱基的瞬间被激发并发出特征性荧光信号，由底部激光实时记录，从而实现"边合成边测序"的单分子实时监测[4]。

PacBio 平台有两种测序模式[4]：

• CLR 模式（continuous long read）：对线性 DNA 模板单次读取，插入片段可达 25–175 kb，但因单次通过错误率较高（约 8%–15%），主要用于需要超长读长的组装场景；
• CCS/HiFi 模式（circular consensus sequencing）：将 DNA 片段两端连接成 SMRTbell 环状文库，聚合酶在环上多次滚环读取同一分子，将多次亚读长（subreads）合并成一条共识序列（HiFi read）。HiFi 读长通常为 10–25 kb，准确率可达 Q33（约 99.9%），兼顾了长读长与高精度，是目前细菌全基因组、质粒与耐药岛解析的重要工具[4]。

1.2 Oxford Nanopore 纳米孔测序

纳米孔测序的原理完全不同：一个蛋白纳米孔嵌入电绝缘的磷脂膜中，膜两侧施加电压形成离子电流；单链 DNA 或 RNA 在酶马达（如解旋酶/聚合酶）的驱动下以一定速度穿过纳米孔，不同碱基通过时引起特征性的电流扰动（current blockade），通过实时测量电流变化即可推断碱基序列[2,4]。

纳米孔测序的特点包括[2,4]：

• 无需扩增与荧光标记，直接对天然核酸分子测序，可避免 PCR 引入的扩增偏倚；
• 读长极长：可达数百 kb 至 Mb 级，已有超过 4 Mb 超长读长的报道[4]；
• 实时测序：数据边测边产生，可在测序运行过程中实时进行碱基识别（basecalling）与物种注释，数分钟即可获得初步结果[1]；
• 单读长准确率相对较低：早期原始读长准确率约 Q20（99%），经 Duplex（双链共同测序）模式可达约 Q30；同聚物区（homopolymer）错误曾是主要短板，R10 系列芯片通过双读取头设计显著改善；
• 可检测碱基修饰：直接识别 5-甲基胞嘧啶（5mC）、5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、N6-甲基腺嘌呤（6mA）等修饰，无需额外化学处理[4]；
• 支持直接 RNA 测序，对 RNA 病毒检测具有潜在优势[2]。

二、操作流程

以临床宏基因组病原体检测为例，三代测序的典型流程如下：

1. 核酸提取与质控：从临床标本（痰液、肺泡灌洗液、血液、脑脊液、尿液等）中提取总核酸。宏基因组检测通常需要去除或降低人源核酸背景（如差速离心、去宿主试剂等），以提高病原体序列占比与检测灵敏度。

2. 文库构建： - ONT 平台：对 DNA 进行损伤修复、末端修复后连接测序接头；快速建库试剂盒（rapid barcoding）可将建库时间压缩至 10 分钟左右，并支持多样本条形码（barcode）混样； - PacBio 平台：构建 SMRTbell 环状文库，HiFi 模式需连接发夹接头形成环化模板； - 若为 16S rRNA 扩增子流程，则以全长 16S rRNA 基因（约 1500 bp）为靶标进行 PCR 扩增并连接条形码，直接以菌液粗提物为模板亦可[5]。

3. 上机测序：根据通量选择设备。ONT 提供从便携式 MinION（U 盘大小，适合床旁/现场）到 GridION、PromethION（高通量）的系列平台，以及低成本的 Flongle 单样本流式芯片；PacBio 目前主流机型为 Sequel IIe 与 Revio。

4. 碱基识别与生信分析：原始电信号经 Guppy/Dorado 等软件实时碱基识别为序列后，进入比对（如 minimap2）、从头组装（如 Flye、Canu）与分类学注释（如 Kraken2、EPI2ME、MetaPORE）等流程；耐药基因预测基于 CARD、ResFinder 等数据库[6]。

5. 报告：综合物种注释、序列数（reads）、基因组覆盖率、相对丰度等信息出具报告，由临床微生物/检验人员结合患者病情解读。

就速度而言，已有研究在6 小时内完成从样本接收到病原体鉴定的全流程（sample-to-answer）[1,7]；ICU 常规呼吸宏基因组服务亦实现了当日报告[3]。

三、应用场景

3.1 宏基因组病原体检测（mNGS）

• 呼吸道感染：Charalampous 等（2019）报道纳米孔宏基因组测序可在 6 小时内快速诊断细菌性下呼吸道感染，灵敏度与传统方法相当[7]；2024 年发表的 ICU 呼吸宏基因组常规服务研究进一步显示，其可每日提供报告，检出病原体与耐药决定簇，并用于感染控制分型[3]。
• 病毒血症与不明原因发热：Greninger 等（2015）利用 MinION 在 4–40 分钟内实时检出埃博拉病毒、基孔肯雅病毒与丙型肝炎病毒，实现 <6 小时的样本-结果全流程[1]。

3.2 耐药基因检测

长读长可跨越完整的耐药基因及其邻近可移动元件，直接鉴定耐药基因并判断其是否位于质粒等可转移元件上[6,8]。Schmidt 等（2017）从临床尿液中直接进行纳米孔宏基因组测序，同时实现细菌鉴定与耐药基因检出[8]；Sauerborn 等（2024）报道实时纳米孔基因组学可检出常规表型检测可能遗漏的"隐藏"耐药（如肺炎克雷伯菌中的低水平耐药相关基因）[6]。

3.3 16S rRNA 全长测序

二代平台通常只能测 16S rRNA 基因的 1–3 个高变区（V1–V3 等），物种分辨率有限；纳米孔长读长可覆盖全长 16S rRNA 基因（约 1500 bp），显著提高物种级鉴定能力[5,9]。Kai 等（2019）建立了从细菌菌液直接 PCR 扩增 16S rRNA 基因并上 MinION 测序的快速流程，省略 DNA 纯化步骤，缩短样本-结果时间[5]。

3.4 疫情监测与现场测序

MinION 便携、低基础设施依赖的特点使其成为疫情现场基因组监测的重要工具，已在埃博拉、寨卡、SARS-CoV-2 等暴发中用于基因组溯源与变异监测；其"边测序边分析"模式适合快速公共卫生响应[1,9]。

3.5 分子流行病学与基因组组装

长读长可完整组装细菌染色体、质粒、耐药岛及重复区，支持医院内传播链分析、暴发溯源与耐药克隆的精准分型[3,4]。

四、优缺点

4.1 优点

1. 读长长：跨越重复区、高 GC 区与结构变异，基因组组装完整度显著优于短读长平台[4]；
2. 实时性：边测序边分析，数分钟至数小时即可获得初步病原体鉴定结果，适合急重症与疫情场景[1,3]；
3. 便携与灵活：MinION 设备体积小、入门成本低，可在基层、床旁及野外部署；通量从单样本（Flongle）到高通量（PromethION）可扩展；
4. 无扩增偏倚：宏基因组模式直接测序天然核酸，可更真实反映样本中微生物组成与相对丰度；
5. 附加信息：直接检测碱基修饰，并支持直接 RNA 测序（利于 RNA 病毒检测）[2,4]。

4.2 缺点与局限

1. 单读长准确率较低：纳米孔原始读长约 Q20，错误以插入/缺失为主，单分子水平变异识别受限[4]；HiFi 虽达 Q33，但以多次读取同一分子为代价，通量与成本受限；
2. 成本与通量：单位碱基测序成本仍高于成熟二代平台，宏基因组临床样本中人源背景核酸会"稀释"有效病原体数据，提高测序成本与深度要求；
3. 生信门槛高：需要专业的碱基识别、注释与解读流程，缺乏统一的行业标准；
4. 临床验证与标准化不足：多数应用仍处于研究或小规模服务阶段，检测阈值、质控与报告规范尚未完全统一；
5. 低丰度病原体灵敏度受限：受核酸提取效率、宿主背景与测序深度影响，阴性结果不能完全排除感染[2,7]。

4.3 与二代测序（Illumina）的定位差异

两者在实际应用中呈互补关系：二代平台用于高通量、低成本批量筛查，三代平台用于快速诊断、完整基因组组装与复杂结构解析[4]。

五、报告解读

临床医生在阅读三代测序报告时，建议关注以下要点：

1. 检出病原体 ≠ 致病菌：宏基因组检出需结合序列数（reads）、基因组覆盖率、相对丰度及标本类型综合判断。呼吸道标本存在定植菌群，检出低丰度机会菌时须警惕污染或定植而非感染[3,7]；
2. 结果时效：纳米孔流程可在 6 小时内完成样本-结果全流程，适合脓毒症、重症肺炎等需要快速决策的场景；但报告时间取决于建库方式、测序深度与生信流程[1,7]；
3. 耐药基因是基因型而非表型：检出耐药基因仅提示耐药"潜力"，实际表达与表型耐药存在差异，尤其对低水平耐药；临床决策仍应结合表型药敏（如 MIC）[6]；
4. 阴性结果的解读：受核酸量、裂解效率、宿主背景与测序深度影响，阴性结果不能排除感染，尤其对胞内菌、厚壁菌与低载量病原体[2]；
5. 与常规检验互补：培养仍是药敏表型与活菌确认的金标准；三代测序不能替代培养，两者应互为补充；
6. 分型与流行病学信息：序列分型（如多位点序列分型）可提示菌株间亲缘关系，有助于判断院内传播与暴发关联[3]。

参考文献

[1] GRENINGER A L, NACCACHE S N, FEDERMAN S, et al. Rapid metagenomic identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis[J]. Genome Medicine, 2015, 7: 99. DOI: 10.1186/s13073-015-0220-9.

[2] PETERSEN L M, MARTIN I W, MOSCHETTI W E, et al. Third-generation sequencing in the clinical laboratory: exploring the advantages and challenges of nanopore sequencing[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2020, 58(1): e01315-19. DOI: 10.1128/JCM.01315-19.

[3] CHARALAMPOUS T, ALCOLEA-MEDINA A, SNELL L B, et al. Routine metagenomics service for ICU patients with respiratory infection[J]. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 2024, 209(2): 164-174. DOI: 10.1164/rccm.202305-0901OC.

[4] WANG B, JIA P, GAO S, et al. Long and accurate: how HiFi sequencing is transforming genomics[J]. Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 2025, 23(1): qzaf003. DOI: 10.1093/gpbjnl/qzaf003.

[5] KAI S, MATSUO Y, NAKAGAWA S, et al. Rapid bacterial identification by direct PCR amplification of 16S rRNA genes using the MinION nanopore sequencer[J]. FEBS Open Bio, 2019, 9(3): 548-557. DOI: 10.1002/2211-5463.12590.

[6] SAUERBORN E, CORREDOR N C, RESKA T, et al. Detection of hidden antibiotic resistance through real-time genomics[J]. Nature Communications, 2024, 15: 5494. DOI: 10.1038/s41467-024-49851-4.

[7] CHARALAMPOUS T, KAY G L, RICHARDSON H, et al. Nanopore metagenomics enables rapid clinical diagnosis of bacterial lower respiratory infection[J]. Nature Biotechnology, 2019, 37(7): 783-792. DOI: 10.1038/s41587-019-0156-5.

[8] SCHMIDT K, MWAIGWISYA S, CROSSMAN L C, et al. Identification of bacterial pathogens and antimicrobial resistance directly from clinical urines by nanopore-based metagenomic sequencing[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2017, 72(1): 104-114. DOI: 10.1093/jac/dkw397.

[9] MITSUHASHI S, KRYUKOV K, NAKAGAWA S, et al. A portable system for rapid bacterial composition analysis using a nanopore-based sequencer and laptop computer[J]. Scientific Reports, 2017, 7: 5657. DOI: 10.1038/s41598-017-05772-5.