【检测技术科普】2026-08-30 靶向高通量测序（tNGS）详解：从原理到报告解读

概述

感染性疾病的早期病原学诊断一直是临床的难点。传统培养耗时长（一般 1–7 天）、苛养菌及病毒检出率低、抗生素暴露后阳性率进一步下降，这些痛点催生了宏基因组二代测序（mNGS）在临床的迅速落地。但 mNGS \"无目标、无偏倚\"的本质带来了高人源背景干扰、高成本（一般 3000 元以上/样本）、对低浓度病原敏感度不佳等问题，因此一种介于\"靶向 PCR panel\"与\"无偏倚 mNGS\"之间的技术——靶向高通量测序（targeted next-generation sequencing，tNGS）——应运而生，并在 2020 年后逐步进入临床。

tNGS 通过预先设计的引物或多探针对样本中数十至数百种临床常见病原体（细菌、真菌、DNA/RNA 病毒、寄生虫）及关键耐药/毒力基因进行靶向富集，再行高通量测序，可以在 16–24 小时内一次性给出较广病原谱的鉴定+耐药提示，且测序量仅为 mNGS 的约 1%，将单样本成本压低到 800–1500 元人民币区间，是当前性价比可被多数三级医院接受的精准病原学检测方案[1-3]。

中国医疗保健国际交流促进会临床微生物学分会于 2024 年 12 月在《中华医学杂志》发表了《靶向高通量测序在感染性疾病中应用与实践专家共识》，由北京大学人民医院王辉教授、中日友好医院曹彬教授领衔制订，对 tNGS 的临床适应证、技术要点、报告解读进行了系统规范，是目前国内最具权威性的 tNGS 应用文件[1]。

一、原理

1.1 核心思想：让测序资源集中在\"临床真正要查的病原\"上

mNGS 采用\"鸟枪法（shotgun）\"——把样本中全部 DNA/RNA 随机打断测序，再用生信比对判读来源。这种无预设的策略对未知病原、罕见病原是优势，但也带来三大短板：

1. 人源核酸占比高——一份肺泡灌洗液（BALF）中 >95% 的核酸来自人体宿主，真正分给微生物的 reads 比例极低；
2. 成本居高——为达到微生物覆盖深度，单次测序数据量常需 20 Gb 以上；
3. 低浓度病原易漏——当病原载量 ≤10³ CFU/mL 时，分配给该病原的 reads 数可能低于检测阈值。

tNGS 的设计理念是先\"富集\"再\"测序\"：在文库构建阶段把无关的人源核酸和无关微生物\"过滤\"掉，使测序读长几乎全部落在目标区域。其底层假设是——临床 95% 以上的常见感染由 200 种以内的病原引起，把这 200 种\"做扎实\"比把上万个物种都\"扫一遍\"更现实[2-4]。

1.2 两种富集技术路线

按富集方式，tNGS 分为两条主流技术路线，国内厂家已基本收敛至这两条：

（1）多重 PCR 扩增法（amplicon-based tNGS）

针对每个目标病原的保守区域（多为 16S rRNA、ITS、RNA 依赖 RNA 聚合酶等）设计引物，单管内进行 100–500 重 PCR。优点：灵敏度高、可设计性强、单管可同时覆盖 DNA+RNA；缺点：引物数量随 panel 增大而显著增加，引物二聚体污染风险随之上升，难以做到极广覆盖[5]。

（2）杂交捕获法（hybrid-capture tNGS）

先用常规文库构建把样本打断、加接头，再用与目标基因组互补的 80–120 bp 生物素标记探针进行液相杂交，最后通过链霉亲和素磁珠拉下靶标序列。优点：可对目标基因组实现\"瓦片式（tiling）\"全覆盖，对基因突变/耐药位点定位更准；缺点：杂交时间长（数小时至过夜）、单样本成本更高、对人源背景去除要求更严[6-7]。

中国 2024 版专家共识明确：多重 PCR 扩增 tNGS 方法靶标少、花费较低；探针捕获 tNGS 方法覆盖病原谱广、花费较高——临床应根据具体场景选择[1]。

1.3 测序平台与读长

主流平台为 Illumina（MiSeq、NextSeq 系列）的边合成边测序（SBS）；华大基因、华因海纳等国产平台使用联合探针锚定聚合技术（cPAS）或滚环扩增（RCA）；近年 Nanopore（Oxford Nanopore）等三代测序平台也开始推出 tNGS 方案，其优势是读长更长（可达数 kb）、单分子实时，但对低频突变的检出敏感度仍弱于 Illumina[5-6]。

读长方面，国内 2024 版共识推荐扩增子长度宜在 200 bp 内，探针长度介于 80–120 bp，测序读长 ≥100 bp 是常见下限[1]。

二、操作流程

tNGS 的完整湿实验—干实验—报告流程在《中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南（2018）》及 2024 共识中均有规范化要求[1,8]。一个标准 tNGS panel 检测通常包含以下 6 步：

2.1 标本采集与前处理（关键质控点 1）

• 首选标本类型：BALF（肺）、脑脊液（中枢神经）、关节液/超声裂解液（关节感染）、尿液（泌尿）、血液（血流）、组织（深部感染）；
• 采集要求：与 mNGS 一致，按 WS/T 640-2018《临床微生物学检验样本的采集和转运》执行[9]；
• 转运保存：BALF、脑脊液等无菌体液建议 4 ℃ 冷藏 2 小时内送检；-80 ℃ 冻存用于延迟送检；
• 去人源：BALF 通常需加入 0.1% saponin 或 DTT 进行红细胞裂解，以降低人源 DNA 占比。

2.2 核酸提取（关键质控点 2）

• 需采用同时兼顾 DNA 和 RNA 回收效率的试剂盒——细菌、病毒、真菌、结核分枝杆菌的破壁难度差异巨大；
• 共识明确要求试剂工程菌不应涵盖在靶标范围内，避免外源污染带来的假阳性[1]；
• 内对照（ spiked phiX 或人工合成序列）应在核酸提取时加入，用于监控全流程损耗。

2.3 文库构建（关键质控点 3）

• 多重 PCR 路径：两轮 PCR——第一轮用病原特异性引物扩增，第二轮引入含 Index 的测序通用接头并富集；
• 杂交捕获路径：常规末端修复/加 A/接头连接后，与生物素探针液相杂交 2–16 小时，磁珠捕获，洗脱；
• 质控：Bioanalyzer/TapeStation 检测文库片段分布，Qubit/qPCR 定量。

2.4 上机测序（关键质控点 4）

• 单样本测序数据量通常 0.1–1 Gb（视 panel 大小），显著低于 mNGS 的 20+ Gb；
• 必须设置阴性对照（无核酸样本）与阳性对照（已知浓度参考菌株）；
• 测序仪需周期性做碱基识别率（Q30+）评估。

2.5 生物信息学分析（关键质控点 5）

• 去人源序列（BWA/BLAST 比对人类参考基因组 GRCh38）；
• 引物二聚体数据库过滤（多重 PCR panel 必备，避免假阳性）；
• 病原微生物数据库比对——参比库通常包括 NCBI nt、RefSeq，以及商品化 panel 提供的精选序列；
• 报告生成：原始 reads 数 → 经均一化处理后的 normalized reads（标准化 reads 数，标准化单位通常为每 100 万 reads 中的 reads 数，RPM/百万）。

2.6 结果判读与临床沟通（关键质控点 6）

由临床微生物学专家结合临床信息、标本类型、检测 panel 覆盖范围、reads 数、耐药基因位点综合判读，绝非\"机器出一份报告就完事\"。这也是共识要求结果判读需临床微生物学专业人员参与的核心理由[1]。

三、应用场景

中国 2024 版专家共识明确 tNGS 适用于 3 大场景：感染性疾病病原体检测、耐药基因检测、公共卫生流行病学病原监测[1]。

3.1 肺部感染—— tNGS 当前最成熟的应用

• 一项纳入 130 例 ICU 重症肺炎患者的回顾性研究显示，tNGS 与临床综合诊断的一致性优于传统培养，与 mNGS 相当[10]；
• 在 BALF 中，tNGS 阳性率约 82.2%（106/129），与 mNGS 的 86.5%（109/126）相当（P = 0.41）[1]；
• 病原谱涵盖肺炎支原体、肺炎衣原体、军团菌、耶氏肺孢子菌等\"难培养或不培养\"病原，弥补了常规 PCR panel（一般只覆盖 5–13 种呼吸道病原）的不足。

3.2 中枢神经系统感染

• 在脑脊液（CSF）样本中，tNGS 的 AUC 可达 0.794，显著高于培养法的 0.568[4]；
• 一项美国 8 家医院 204 例的前瞻性队列（涉及成人与儿科）显示，tNGS 联合常规检查可在 22% 的病例中额外给出可指导治疗的病原学诊断[11]；
• 主要针对病毒性脑炎（HSV、VZV、肠道病毒）、细菌性脑膜炎（培养阴性的李斯特菌、钩端螺旋体等）、结核性脑膜炎。

3.3 血流感染

• 在血液样本（病原载量常 ≤10³ CFU/mL）中，tNGS 仍可保持 70.8–95.0% 的灵敏度[2]；
• 显著高于血培养（23.2%）与 mNGS 的约 69.6%，且对先前抗生素暴露影响较小[4]。

3.4 结核分枝杆菌及耐药鉴定（独特价值）

mNGS 对结核分枝杆菌耐药位点的判断力较弱，tNGS 可在覆盖结核全基因组后给出 rpoB（利福平）、katG（异烟肼）、gyrA（氟喹诺酮）等关键耐药位点的序列变异信息；研究显示在儿童结核中，tNGS 较 Xpert MTB/RIF 多检出 利福平和丙硫异烟胺耐药病例[3-4]。

3.5 病毒变异监测与公共卫生

• COVID-19 流行期间，tNGS 被大量用于 SARS-CoV-2 全基因组测序、污水监测与溯源[12-13]；
• 当前已扩展至流感病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）、猴痘病毒（MPXV）等病原的变异追踪，是疾控机构的新一代工具之一。

3.6 其他场景

四、优缺点

4.1 优势（相对传统培养）

• 病原谱广：单次检测 100–500 种病原与数十种耐药基因；
• 耗时短：从样本接收到报告 16–24 小时，远快于培养；
• 不依赖培养：苛养菌、胞内菌、病毒、寄生虫同等覆盖；
• 耐药信息：同步给出耐药基因型，mNGS 通常无法做到。

4.2 优势（相对 mNGS）

4.3 局限性（必须明确告知临床）

1. 依赖预设 panel——无法检测 panel 之外的新发病原或罕见变异；这是与 mNGS 最大的功能差异[1,3]；
2. 阴性不能排除感染——共识明确\"阴性结果不建议单独作为排除依据\"[1]；
3. 解读依赖 panel 信息——临床医生必须知道厂家 panel 的具体靶标覆盖，否则可能误判阴性；
4. 环境/试剂污染风险——多重 PCR 体系对引物二聚体和外源微生物序列敏感，需严格分区操作与阴性对照；
5. 耐药表型预测仍属辅助——基因型 ≠ 表型，临床决策仍以培养药敏为金标准[1]；
6. 阳性阈值无统一标准——同一病原在免疫缺陷患者与免疫正常者的 \"致病 reads 数\" 完全不同，需结合临床综合判断[3]。

五、报告解读

tNGS 报告单通常按以下结构呈现（参见共识 26 条推荐的报告模板）[1]：

5.1 报告应包含的 5 大板块

5.2 三级判读原则（共识 23、24、25 条的核心要求）

（1）结合标本类型与采集部位

血液、BALF、CSF 等\"相对无菌\"标本里检出即临床意义大；痰液、咽拭子等\"有正常菌群\"的标本需结合半定量 reads 判断（同一阈值下不同标本意义可能截然相反）。

（2）以\"标准化 reads 数\"而非原始 reads 数判断

RPM（每百万 reads 中的目标 reads）是共识推荐的标准化指标，便于跨样本、跨实验室横向比较。但需注意：目前各厂家 panel 的 RPM 计算公式未统一，跨厂家横向比较时应谨慎[1]。

（3）结合\"均一化序列数 + 临床信息 + panel 覆盖\"综合判读

共识明确建议将检出病原按 「明确致病 > 可能致病 > 定植/污染 > 意义不明」 四级分类，并将该判读责任放在临床微生物学专业人员而非算法本身[1]。

5.3 常见临床沟通误区（锋哥提醒）

• 误区 1：「tNGS 阳性 = 致病」——错。reads 数低可能是死菌、定植或环境污染；
• 误区 2：「tNGS 阴性 = 排除感染」——错。可能 panel 未覆盖；
• 误区 3：「耐药基因阳性 = 该抗生素一定耐药」——错。基因型必须结合表型药敏；
• 误区 4：「比 PCR 准所以可以替代 PCR」——错。两者用途不同，PCR 速度快、靶标深，是 tNGS 的互补不是替代。

参考文献

[1] 中国医疗保健国际交流促进会临床微生物学分会. 靶向高通量测序在感染性疾病中应用与实践专家共识[J]. 中华医学杂志, 2024, 104(48): 4375-4383. DOI: 10.3760/cma.j.cn112137-20240927-02208.

[2] Chen Q, Yi J, Liu Y, et al. Clinical diagnostic value of targeted next-generation sequencing for infectious diseases (Review)[J]. Mol Med Rep, 2024, 30(3): 153. DOI: 10.3892/mmr.2024.13277.

[3] Liang, Wu. Targeted next-generation sequencing (tNGS): an upcoming application for pathogen identification in clinical diagnosis[J]. J Infect Public Health, 2025. PMID: 40857774. DOI: 10.1016/j.jiph.2025.102858.

[4] Rong R, Long Y, Li Y, et al. Metagenomic and Targeted Next-Generation Sequencing in Infectious Disease Diagnostics: Current Applications, Challenges, and Future Perspectives[J]. Diagnostics, 2026, 16(7): 991. DOI: 10.3390/diagnostics16070991.

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[8] 中华医学会呼吸病学分会. 中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南(2018)[J]. 中华结核和呼吸杂志, 2018, 41(4): 255-280. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1001-0939.2018.04.006.

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[10] 临床应用靶向高通量测序在重症肺炎中的回顾性研究[J]. (Anonymized ICU retrospective cohort, n=130, 2022–2023). PMC11232260.

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