【检测技术科普】2026-09-06 宏基因组二代测序（mNGS）在感染性疾病诊断中的应用详解

概述

宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）是一种对临床标本中全部微生物核酸（DNA 与 RNA）进行高通量、随机"鸟枪法"（shotgun）测序，并通过生物信息学比对识别病原体的检测方法。与传统的培养、免疫学及靶向核酸检测相比，mNGS 的核心优势在于"不依赖预设"——无需事先推断可能的病原体即可在一次实验中同时覆盖细菌、病毒、真菌、寄生虫及部分非典型病原体，因而被国内外指南和共识定位为疑难、危重症及特殊人群感染的重要辅助诊断工具[1-2]。

mNGS 临床应用起源于 2014 年 Wilson 等在新英格兰医学杂志报道的脑脊液 mNGS 诊断钩端螺旋体脑膜脑炎病例——一例 14 岁男孩在 >50 项 PCR、血清学、培养均阴性的情况下，脑脊液 mNGS 在 800 余万条序列中检出 <500 条钩端螺旋体特异性序列并据此修正治疗[3]。该病例成为临床宏基因组学的里程碑事件。此后十余年间，mNGS 已在中枢神经系统感染、下呼吸道感染、血流感染、骨关节感染、免疫缺陷宿主感染及新发突发传染病病原鉴定等领域积累了系统证据，2024 年美国感染病学会（IDSA）与美国微生物学会（ASM）联合发布的《微生物实验室应用指南》已将其纳入难诊感染性疾病的辅助工具[4]。

本文核心提示：mNGS 是"无假设"的广谱筛查工具，并非传统培养与靶向 PCR 的替代品；其临床价值高度依赖采样质量、湿实验流程、生信分析与临床解读四个环节的标准化[1,5]。

一、原理

1.1 基本概念

mNGS 的理论基础是：临床标本中所有核酸（包括人源核酸与微生物核酸）的混合物经随机打断、加接头、扩增后并行测序，所得序列与参考数据库比对即可识别微生物种属[1,5]。由于不依赖特异性引物或探针，理论上可检出标本中任何核酸含量达到检出阈值的微生物，包括难以培养、罕见或新发病原体。

1.2 文库类型

按测序对象可分为： - DNA 文库（DNA mNGS）：覆盖细菌、真菌、DNA 病毒、寄生虫、支原体等； - RNA 文库（RNA mNGS）：可同时覆盖 RNA 病毒（如流感、冠状病毒、肠道病毒）并保留转录组信息，有助于判断病原活性，但 RNA 易降解、对运输保存要求更高[1,5]。

临床实验室常采用"DNA + RNA 平行检测"或"统一去宿主后总核酸测序"两种策略，后者兼顾两者优势[6]。

1.3 测序平台

临床 mNGS 主要使用短读长平台，以 Illumina NextSeq / NovaSeq 系列为代表；近年来 Oxford Nanopore、PacBio 等长读长平台亦开始进入临床，优势在于实时测序（最快 6–8 h 出报告）、耐药基因/质粒分型能力强，但对仪器和生信要求较高[1,7]。Chiu 与 Miller 在 Nature Reviews Genetics 综述中指出，短读长平台仍是当前临床 mNGS 主流[1]。

1.4 关键生物信息学步骤

生信流程决定结果可靠性，核心步骤包括： 1. 质量过滤：去除低质量序列与接头； 2. 去人源序列（human reads depletion）：通过 BWA 等比对到人类参考基因组后剔除，是提升病原体相对丰度的关键环节，可使病原序列占比提高 10–100 倍[1,8]； 3. 病原体分类学比对：与 NCBI nt/nr、GenBank 及专用临床数据库（如 IDbyDNA、VIROMED、Karius 等）比对； 4. 背景过滤与阈值判定：通过阴性对照、本底微生物库、自建统计模型（如 Du 等的"文库浓度归一化"模型）评估检出序列是否显著高于背景[9]； 5. 耐药基因/毒力基因注释：基于 CARD、ResFinder、VFDB 等数据库注释，但目前仅作"线索"使用，不能替代传统药敏[1,10]。

二、操作流程

完整的临床 mNGS 流程包括"湿实验"（采样–提取–建库–测序）与"干实验"（生信–报告）两大部分，中华医学会检验医学分会发布的《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识（2021）》对各环节给出了规范化建议[2]。

2.1 标本采集与运输

• 推荐无菌操作采集，避免皮肤、黏膜常居菌污染；
• 标本类型包括：脑脊液（CSF）、血液、肺泡灌洗液（BALF）、胸腹水、关节液、组织、尿液、脓液、咽拭子等；
• 低温运输（4 ℃ 短期、–80 ℃ 长期），DNA/RNA 同步检测时建议使用专用核酸保护液[2,5]。

2.2 核酸提取与去宿主

• 使用经过临床验证的提取试剂盒，对难破壁真菌、分枝杆菌、支原体等推荐加入机械珠磨（bead-beating）步骤以提高得率[11]；
• 提取后采用 DNase I 或基于探针杂交的方法去除人源 DNA，可显著提高低生物量标本的检出灵敏度[8]。

2.3 文库构建与测序

• 典型流程：片段化 → 末端修复 → 加接头 → PCR 扩增 → 质控 → 上机；
• 单样本测序数据量通常 5–20 M reads（DNA）/10–30 M reads（RNA），靶病原体数与标本背景决定具体深度[1,2]；
• 报告周期：当前国内实验室多为 24–48 h，部分基于 Nanopore 的快速方案可缩短至 6–8 h[1,7]。

2.4 生信分析与报告解读

生信分析需配置严格的阴性对照（环境对照、试剂对照、同批次空白对照）以建立背景阈值。中华医学会检验医学分会另一份共识《宏基因组测序病原微生物检测生物信息学分析规范化管理专家共识》专门规定：每个实验室必须建立并验证内部阈值参数，且阳性报告需经临床微生物学与临床医学人员联合解读后发出[12]。

三、应用场景

3.1 中枢神经系统感染

CNS 感染起病急、致死致残率高，传统病原学阳性率不足 50%。Xing 等前瞻性纳入 213 例脑炎/脑膜炎患者的系列研究显示，mNGS 在脑脊液中的总体阳性率显著高于培养，且对结核分枝杆菌、布鲁氏菌、新型隐球菌、单纯疱疹病毒等常见与罕见病原均有较高灵敏度[13]。中华医学会神经病学分会 2021 年发布的《中枢神经系统感染性疾病的脑脊液宏基因组学第二代测序应用专家共识》推荐，对疑似 CNS 感染但常规检查阴性的患者尽快送检 mNGS[14]。

3.2 下呼吸道感染

传统痰培养阳性率低、易受口咽菌群污染。BALF mNGS 在混合感染、非典型病原（嗜肺军团菌、肺炎支原体、鹦鹉热衣原体）、真菌（肺孢子菌、曲霉）及免疫缺陷宿主肺部感染中优势显著[1,15]。中华医学会呼吸病学分会 2023 年发布的《下呼吸道感染宏基因组二代测序报告临床解读路径专家共识》系统规定了报告判读流程与抗生素调整建议[15]。

3.3 血流感染与脓毒症

血培养灵敏度仅 5%–50%，且受既往抗菌药物使用影响大。Karius 测序（基于血浆微生物 cfDNA）是目前商业化最成熟的血液 mNGS 产品，Blauwkamp 等报告其临床灵敏度 93.7%（95%CI 84.5%–98.2%）、特异度 40.0%（95%CI 34.3%–45.9%，vs 初次血培养）；纳入全部微生物学检测时灵敏度 84.8%（95%CI 77.6%–90.5%）、特异度 48.2%（95%CI 44.3%–55.0%）[16]。然而独立多中心研究显示其阳性结果对临床实际抗感染管理调整的"阳性影响"仅约 7.3%，提示应建立严格的送检指征与多学科解读机制[17]。

3.4 免疫缺陷与疑难感染

中华医学会血液学分会抗感染学组 2023 年发布的共识对血液病/造血干细胞移植患者的 mNGS 送检指征做了详细规定，推荐用于：①经验性治疗无效的发热；②局灶感染、影像学不典型；③少见病原（耶氏肺孢子菌、诺卡菌、毛霉、腺病毒、CMV、HSV 等）的早期识别[18]。此类人群中 mNGS 的临床影响显著高于普通人群。

3.5 骨关节、腹腔、泌尿、皮肤软组织感染

mNGS 在关节液、BALF、胸腹水、组织标本中均显示较培养更高的灵敏度，特别是在培养阴性、慢生长或苛养菌（如分枝杆菌、布鲁氏菌、放线菌）感染中[19]。Miao 等纳入 511 份标本的多中心研究显示，mNGS 总体灵敏度 50.7%、特异度 85.7%，在骨关节与中枢神经系统感染中表现最佳[20]。

3.6 新发突发传染病

mNGS 已在 SARS-CoV-2、Monkeypox virus、Ebola virus、SFTS virus 等多次疫情中作为病原学"破冰"工具，被 WHO 与各国 CDC 推荐为未知病原筛查方法之一[1,5]。

3.7 宿主–病原整合分析与二代测序扩展

近年研究将宿主转录组特征（host response signature）与 mNGS 微生物结果联合建模，用于脓毒症[21]、结核性脑膜炎[22]、重症肺炎[23]的鉴别诊断与预后评估。这一"双信号"策略被 IDSA/ASM 2024 指南视为未来重要方向[4]。

四、优缺点

4.1 优势

4.2 局限与挑战

五、报告解读

mNGS 报告必须由临床微生物学专业人员与临床医师联合解读，中华医学会呼吸病学分会 2023 共识给出了标准化解读路径[15]，可概括为"三步判读法"：

5.1 第一步：评估检测质量

• 测序数据量、内参（spike-in 或人为添加的伪病毒/细菌）回收率；
• 人源序列占比与去宿主效率；
• 阴性对照、本批次背景微生物列表；
• 任一关键质控指标不合格需重做或判为"结果不可靠"[2,12]。

5.2 第二步：判断病原体意义

按以下三个维度综合判断： 1. 病原种类：结核分枝杆菌、布鲁氏菌、军团菌、耶氏肺孢子菌、腺病毒、JC 病毒、SFTS 病毒等报告即应高度警惕；表皮葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌、不动杆菌、肠球菌等需结合临床与背景排除定植/污染[1,5]； 2. 相对丰度与特异序列数：原始序列数（reads 数）、RPM/RPMM（每百万 reads 比对到该病原的 reads）、基因组覆盖度；通常特异 reads ≥1 且显著高于背景、本底数据库阴性对照即可初步阳性[2,12]； 3. 临床契合度：与症状体征、影像学、其他实验室检查（血常规、PCT、CRP、病理、培养、抗体）是否吻合；不吻合时优先考虑非致病性检出。

5.3 第三步：指导临床决策

• 初治患者：若检出与临床表现吻合的传统方法漏检病原，可据此降阶或换用靶向治疗；
• 重症/免疫缺陷患者：若检出潜在病原且传统检查阴性，可在评估后经验性升级覆盖，避免延误；
• 疗效评估：连续监测 RNA mNGS 信号或病原 reads 数变化可作为疗效线索，但目前尚不作为正式停药标准[1,15]；
• 多重病原：混合感染在重症肺炎、免疫缺陷宿主中常见，应结合临床判断主要致病菌与共病原，而非"见阳性即治疗全部检出微生物"[1,15]。

5.4 常见误区

• "阳性 = 致病"：mNGS 灵敏度过高可能放大定植/污染，必须临床解读；
• "阴性 = 排除感染"：低生物量、高背景、抗菌药物预处理均可致假阴性；
• "耐药基因 = 表型耐药"：基因型 ≠ 表型，必须以培养药敏为准[1,16]；
• "一次检测定终身"：病情变化时建议复查以评估病原动态与疗效[15]。

参考文献

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