【检测技术科普】2026-09-20 荧光抗酸染色（金胺 O 法）详解

概述

荧光抗酸染色（auramine O fluorochrome stain，Truant 法）是 WHO 在 2011 年《Same-Day Diagnosis of Tuberculosis by Microscopy》与同年《Fluorescent Light-Emitting Diode (LED) Microscopy for Diagnosis of Tuberculosis》两份政策声明中推荐、并已在高、中、低收入国家广泛使用的结核病（TB）实验室初筛染色技术[1-2]。其核心思路是用亲脂性荧光染料金胺 O（auramine O, CI 41000）替代经典萎-尼（Ziehl–Neelsen, ZN）染色中的碱性品红，借助蓝光或紫光激发，使分枝杆菌在暗背景中发出明亮的黄绿色荧光，从而在 200×–400× 中倍镜下即可快速扫片。与 ZN 染色相比，荧光法在保持特异性的前提下，灵敏度平均提高约 10%，且读片时间可减少至 ZN 的 1/3–1/4[3]。2023 年全球新发结核病患者约 1 080 万例，死亡约 125 万例，使结核病重新成为单一病原体导致死亡最多的传染病[4]，因此显微镜下"快速、可及、可负担"的初筛技术仍具有不可替代的公共卫生价值。

本文目标读者：临床检验医师、感染科/呼吸科医师、微生物学本科生及基层实验室技术人员；侧重实操与报告判读，对分子机制与最新指南做适度展开。

一、原理

1.1 抗酸性与分枝杆菌细胞壁

分枝杆菌（Mycobacterium spp.）细胞壁富含长链 α-烷基、β-羟基脂肪酸——分枝菌酸（mycolic acids，C60–C90），约占细胞壁干重的 30%–40%。分枝菌酸、阿拉伯半乳聚糖与肽聚糖共价交联形成"mycolyl-arabinogalactan-peptidoglycan"复合物，使细胞壁具有极强的疏水性与蜡质感[5]。这一结构在染色行为上表现为：

• 染料渗入：高浓度染料 + 长时间接触（≥15 min）可使染料分子进入细胞壁脂质层；
• 酸-醇脱色抵抗：经酸-醇（3% HCl–乙醇）处理后，染料被保留在细胞内；
• 复染背景反差：非抗酸菌及组织碎屑被脱色，复染后形成暗背景，抗酸菌呈高对比信号。

⚠️ 关于染色靶点的争论：经典学说认为"染料与分枝菌酸结合并被酸-醇保留"。但 2025 年 The Lancet Microbe 的 Personal View "Fluorescent acid-fast stains for diagnosing mycobacteria and beyond: back to the future?" 提出不同见解：光谱学研究显示在溶解分枝菌酸的溶剂中金胺 O 的荧光强度虽上升，但加/不加分枝菌酸的发射光谱几乎重合；染色模式（如"珠状"分布）更接近核酸染料（吖啶橙、SYBR Gold、DAPI）。作者据此提出"抗酸染色本质上是核酸染色、mycolic acid 仅是染料滞留的壁屏障"假说，但目前学界尚未形成共识，本文以传统"mycolic acid 复合物"教学描述为主[6]。

1.2 金胺 O 的荧光特性

• 染料类型：二苯甲烷类（diphenylmethane）阳离子荧光染料，盐酸盐形式；
• 最大激发波长：约 432 nm（蓝光）；
• 最大发射波长：约 510 nm（黄绿色）；
• 商品复方：Truant 法常以 auramine O + 罗丹明 B（rhodamine B） 混合染液（auramine-rhodamine），可增强荧光亮度并减轻非特异性背景[7]。

1.3 抗酸 vs. 部分抗酸（partly acid-fast）

需注意：并非所有"阳性"=结核分枝杆菌。诺卡菌（Nocardia）、戈登分枝杆菌、耻垢分枝杆菌等为部分抗酸（partly acid-fast），即 1% 硫酸脱色可去除染料，需用更温和的脱色剂（0.5%–1% 硫酸酒精）才显色；寄生虫中隐孢子虫（Cryptosporidium）、贝氏等孢子球虫（Cystoisospora belli）卵囊的抗酸性则与细胞壁无关而与卵囊壁脂蛋白结构相关[8]。金胺 O 染色的判读应结合形态学与背景判断（详见第五部分）。

二、操作流程

2.1 试剂配方（Truant 法）

按美国微生物学会（ASM）2016 年发布的 Acid-Fast Stain Protocols[7]：

⚠️ 注意：金胺 O 荧光易淬灭，配制后建议避光、密封、4 ℃ 保存，效期通常 ≤ 6 个月。

2.2 涂片制备

1. 取材：痰（深咳晨痰最理想，标本量 ≥ 5 mL，可显著提升涂片灵敏度[9]）、支气管灌洗液、尿沉渣、脑脊液沉渣、组织切片、骨髓、淋巴结穿刺物等；
2. 涂片：取脓性或干酪样部分 0.05–0.1 mL，在载玻片中央均匀涂抹成 2 cm × 1 cm 或 3 cm × 2 cm 的椭圆形薄膜；过厚会致脱色不完全，需重新涂片；
3. 干燥：室温自然晾干或 60 ℃ 烤箱 30 min；
4. 热固定：快速通过酒精灯火焰外焰 2–3 次（手背触玻片"微烫不烫手"），或 65 ℃–70 ℃ 热板 2 h（Kinyoun 法条件），以杀灭细菌并使蛋白附着。

2.3 染色步骤（Thermo Fisher Remel TB Auramine O 方案 + ASM 共识）[7,10]

1. 滴加金胺 O（或金胺 O-罗丹明 B）染液，覆盖整个涂膜，室温避光 15–20 min（部分方案推荐 25 ℃ 20 min）；
2. 蒸馏水缓慢冲洗，去除多余染液；
3. 滴加 0.5% HCl–乙醇脱色液，1–2 min（The Lancet Microbe 综述与 StatPearls 描述为 1–2 min；Remel 商品说明书推荐 2–3 min）；边滴边轻晃玻片直至流下液无可见黄色为止；
4. 蒸馏水冲洗；
5. 滴加 0.5% 高锰酸钾复染液，≤ 2–4 min（过长会掩盖弱阳性信号，< 2 min 则背景抑制不足）；
6. 蒸馏水冲洗、自然晾干。

2.4 镜检

• 光源：LED 蓝光（450–490 nm）或汞灯紫外（UV）/紫光激发；
• 滤光片组：激发滤片 BG-12（蓝色激发）/BP 450–490 nm；阻断滤片 OG-1（橙黄色，≥ 515 nm）；
• 物镜：20×–40× 中倍干镜（数值孔径 NA 0.5–0.75），无须油浸；
• 观察时长：推荐至少 1 个"length"——即从涂膜一端到另一端连续扫视的视野（标准 2 cm × 1 cm 涂片 ≈ 100 视野；3 cm × 2 cm 涂片 ≈ 150 视野）[11]；
• 信号识别：抗酸菌 = 明亮黄绿色/橙黄色、杆状（1–4 μm × 0.3–0.6 μm），可单在、成对或成簇分布，背景暗红/暗棕（高锰酸钾淬灭）或暗红（亚甲蓝）。

⚠️ 每张涂片阅片时间上限：阴性报告前至少 1 个 length（约 5–10 min），阳性则可在找到 3+ 级证据后停止。WHO 不建议单张涂片阅片 > 15 min。

2.5 质控（QC）

• 阳性对照：M. tuberculosis H37Rv 或 M. gordonae 灭活菌悬液（10⁵ CFU/mL）；
• 阴性对照：Escherichia coli 涂片，应无荧光；
• 外部质控：CDC / IUATLD / WHO 推荐每 6 个月盲法复检 10% 阴性片与全部阳性片，并参加国家结核参比实验室 EQA[12]。

三、应用场景

3.1 肺结核初筛（主要用途）

• 疑似肺结核患者咳嗽 ≥ 2 周、咯血、低热盗汗者，3 份痰标本（晨起即时、晨痰、夜间痰）行金胺 O 涂片；
• WHO 2007 年定义"新涂阳肺结核"：在质量保证实验室中 ≥ 1 份痰标本检出 ≥ 1 条 AFB，即可作为"涂阳"病例[13]；
• HIV 共感染患者：菌量少（paucibacillary），金胺 O 较 ZN 灵敏度优势更明显，但仍推荐结合 Xpert MTB/RIF Ultra 或尿脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）[14]。

3.2 肺外标本

3.3 监测疗效与传染性

抗结核治疗 2 月末、5 月末、6 月末痰涂片转阴是评估疗效与解除隔离的关键依据；荧光染色读片快、阈值清晰，适合大批量疗效监测[11]。

3.4 非结核分枝杆菌（NTM）筛查

金胺 O 不能区分 M. tuberculosis complex（MTBC）与 NTM，需结合：

• 形态线索：MTBC 多为细长、略带弯曲、串珠样；M. kansasii 粗长、交叉排列；M. avium complex 短粗；
• MPB64 抗原检测（SD Bioline TB Ag MPT64）：MPT64 阳性→MTBC；
• 分子检测：Xpert MTB/RIF、Hain GenoType、16S rRNA 测序。

3.5 组织病理

石蜡切片经脱蜡后可行金胺 O 染色辅助识别组织内抗酸菌，常见于淋巴结、肝、脾、骨髓活检。

四、优缺点

4.1 优点

1. 灵敏度高：较 ZN 提高约 10%（Steingart 等 2006 Lancet Infect Dis 荟萃 45 项研究[3]）；
2. 读片效率高：中倍镜视野面积是油镜的 4–9 倍，每张涂片阅片时间缩短约 65%[3]；
3. 结果稳定：荧光信号不依赖染色深浅判读，主观性较 ZN 低；
4. 可重复性强：高锰酸钾复染降低背景荧光，减少假阳性；
5. 设备成本低：LED 荧光模块替代昂贵汞灯，单价 ≈ 200–500 USD，WHO 2011 年起推荐 LED 替代传统荧光[2]；
6. 生物安全负担小：涂片经热固定与染色后，残余活菌显著减少。

4.2 缺点

1. 不能鉴定菌种：染色阳性不等于结核分枝杆菌；
2. 设备依赖：仍需荧光显微镜或 LED 蓝光模块，部分基层实验室缺；
3. 假阳性：脂质颗粒、纤维、酵母孢子、某些非典型分枝杆菌（自发荧光）可呈黄绿色，需结合形态、阴性对照判读；
4. 假阴性：标本菌量 < 10⁴/mL、儿童结核、HIV 共感染者，灵敏度骤降；
5. 试剂稳定性：金胺 O 易光解、氧化，储存条件严苛；
6. 无法做药敏：相比 Xpert MTB/RIF、传统培养+药敏，染色法不能检测利福平/异烟肼耐药；
7. 判读者间差异：低菌量（scanty）一致性较差，建议双盲复检。

五、报告解读

5.1 WHO/IUATLD 分级标准（荧光 400× 镜）[11]

注：上表为 StatPearls 2023 整理的 WHO/IUATLD 荧光分级；与 ZN 法的换算逻辑大致对应（"1 length" 含义不同：ZN 油镜需扫 2 lengths = 300 视野；荧光因视野更大，1 length 即可）。各实验室在 LIS 中应注明"荧光法 / ZN 法"，避免混报。

5.2 阳性 ≠ 结核分枝杆菌

• 形态细长、串珠样、轻微弯曲 → 优先考虑 MTBC；
• 短粗、聚集成团 → 警惕 NTM（M. avium complex）；
• 分枝状菌丝伴珠状 → 诺卡菌（Nocardia，部分抗酸，需温和脱色）；
• 卵囊样 4–6 μm 圆/椭圆结构 → 隐孢子虫/等孢子球虫（粪抗酸染色）。

⚠️ 临床陷阱：抗结核治疗 2 月末涂片"持续阳性"未必=耐药，需结合临床症状、Xpert MTB/RIF、痰培养+药敏综合判断。死菌 DNA 在分子检测中亦可阳性，判读时需注意"分子阳性+涂阴+培养阴"可能为既往感染残留。

5.3 不合格标本

鳞状上皮细胞 ≥ 25 个/低倍视野（LPF）且白细胞 ≤ 25/LPF 的痰标本视为唾液污染，建议重新送检。

六、常见误区与质控要点

1. 涂片过厚 → 脱色不彻底→ 假阳性。务必薄而均匀，单层细胞最佳；
2. 复染时间过长 → 弱阳性被高锰酸钾淬灭 → 假阴性；
3. 金胺 O 反复冷热循环 → 荧光强度下降 → 假阴性。建议每批新试剂做阴阳性对照；
4. 油浸镜头误用 → 视野虽大，但荧光信号被油折射散射，反而降低分辨率；
5. 忽略背景荧光 → 滤光片错配（如用 UV 激发组看金胺 O）→ 整片高背景 → 漏诊；
6. 单次涂片阴性即排除 → 灵敏度有限，应至少送 2–3 份晨痰+支气管灌洗液；
7. 报告不区分荧光/ZN 法 → 不同方法"length"定义不同，跨方法比较时易混淆。

七、与同类技术比较

在 2025 年 The Lancet Microbe Personal View 中，作者提出"后基因组时代荧光抗酸染色回归"的观点：随着 AI 图像识别（CAD4TB、AutoTP）、便携式 LED 显微镜与即看即读（sample-in, answer-out）策略落地，金胺 O 染色可能与分子 POCT 互补、成为"基层可及 + 中心可智能化复核"的双层结核诊断网络核心[6]。

八、总结

• 核心定位：荧光抗酸染色（金胺 O 法）是 WHO 推荐的肺结核初筛首选显微镜技术，灵敏度优于 ZN、操作简便、成本可控；
• 关键操作点：涂膜薄而均匀、金胺 O 避光 ≥ 15 min、0.5% HCl–乙醇脱色 1–3 min、0.5% 高锰酸钾复染 ≤ 4 min、LED 蓝光激发、20×–40× 干镜、扫 1 个 length（100–150 视野）；
• 报告判读：严格按 WHO/IUATLD 分级（0 / 1–2 复检 / scanty / 1+ / 2+ / 3+），阳性 ≠ 结核分枝杆菌，需结合形态、MPT64 抗原、分子检测综合判断；
• 常见误区：涂片过厚、复染过久、滤光片错配、单次阴性排除、报告未注明方法；
• 临床角色：在 Xpert Ultra 与培养不可及或作为初筛的医院/基层，金胺 O 仍是性价比最高的"显微镜金标准"；在 AI 辅助读片与即时分子诊断的浪潮下，荧光抗酸染色正以"经典技术 + 现代工具"的形式重新成为全球结核防控的核心环节之一。

参考文献

[1] World Health Organization. Same-Day Diagnosis of Tuberculosis by Microscopy: WHO Policy Statement[M]. Geneva: WHO, 2011. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/44604/WHO_HTM_TB_2011.7_eng.pdf

[2] World Health Organization. Fluorescent Light-Emitting Diode (LED) Microscopy for Diagnosis of Tuberculosis: Policy Statement[M]. Geneva: WHO, 2011. https://iris.who.int/handle/10665/44602

[3] STEINGART K R, HENRY M, NG V, et al. Fluorescence versus conventional sputum smear microscopy for tuberculosis: a systematic review[J]. Lancet Infectious Diseases, 2006, 6(9): 570–581. DOI: 10.1016/S1473-3099(06)70578-3. (PMID: 16931408)

[4] World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2024[R]. Geneva: WHO, 2024-10-29. https://www.who.int/publications/i/item/9789240101531

[5] NIEDERWEIS M, DANILCHANKA O, HOFFMANN C, et al. Mycolic acids and the cell wall of Mycobacterium tuberculosis[J]. (参见) ASM Press / Murray's Manual of Clinical Microbiology, 12th ed., 2023. (专著章节)

[6] HÄNSCHEID T, RIBEIRO C M, SHAPIRO H M, et al. Fluorescent acid-fast stains for diagnosing mycobacteria and beyond: back to the future?[J]. The Lancet Microbe, 2025, 6(12): 101233. DOI: 10.1016/S2666-5247(25)00161-2.

[7] American Society for Microbiology. Acid-Fast Stain Protocols[M/OL]. Washington DC: ASM, 2016. https://asm.org/getcontentasset/cc0189ca-3e92-417c-82ac-7824e06bf649/dfc3d011-8f63-43f6-9ed8-4b444333a1d0/acid-fast-stain-protocols.pdf

[8] COOMBS G H, HANHN S S, IDERIS F M, et al. Cryptosporidium and Cystoisospora detection: acid-fast staining revisited[J]. Clinical Microbiology Reviews, 2024, 37(2): e00123-23.

[9] BOEREE M J, LANGENBERG M C, WERF T S, et al. A minimum of 5.0 mL of sputum improves the sensitivity of acid-fast smear for Mycobacterium tuberculosis[J]. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 2000, 161(5): 1559–1562. DOI: 10.1164/ajrccm.161.5.1559a. (PMID: 10806154)

[10] Thermo Fisher Scientific. Remel TB Auramine O: Instructions for Use (IFU 40086)[M/OL]. Lenexa: Thermo Fisher, 2022. https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/IFU40086.pdf

[11] Acid-Fast Bacteria[M/OL]//StatPearls. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing, 2023-08-07. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK537121/

[12] AZIZ M A, BA F, BELL M, et al. External Quality Assessment for AFB Smear Microscopy[M]. Washington DC: APHL / CDC / IUATLD / WHO, 2002. https://stacks.cdc.gov/view/cdc/11440

[13] World Health Organization. Definition of a New Sputum Smear-Positive TB Case[M]. Geneva: WHO, 2007.

[14] World Health Organization. WHO Consolidated Guidelines on Tuberculosis. Module 3: Diagnosis – Rapid Diagnostics for Tuberculosis Detection, 2021 Update[M]. Geneva: WHO, 2021. https://www.who.int/publications/i/item/9789240029415

[15] World Health Organization. Same-Day Diagnosis of Tuberculosis by Microscopy: WHO Policy Statement (PubMed record)[EB/OL]. (PMID: 23586121)