【检测技术科普】2026-10-04 药敏试验（KB 纸片法）详解

概述

药敏试验（KB 纸片法），全称 Kirby-Bauer 纸片扩散法，是临床微生物实验室最经典、最广泛使用的抗菌药物敏感性检测方法之一。其原理是将含有定量抗菌药物的纸片贴附于接种了待测细菌的琼脂平板表面，药物通过琼脂介质向周围扩散，形成浓度梯度；同时细菌在平板上生长。若该药物能抑制细菌生长，则在纸片周围形成透明抑菌圈，抑菌圈直径的大小与细菌对该药物的敏感性呈正相关。实验室测量抑菌圈直径，对照 CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute）判读标准，将结果判定为敏感（S, Susceptible）、中介（I, Intermediate）或耐药（R, Resistant），为临床抗感染治疗提供用药依据[1][2]。

KB 纸片法的核心价值在于：操作简便、成本低廉、无需昂贵仪器设备，适合各级医疗机构开展；同时方法高度标准化，由 CLSI M02 文件提供全球共识操作规程，结果可跨实验室比较[1][2]。CLSI M02 标准现已更新至第 14 版（2024 年 3 月发布），配套判读标准见 CLSI M100 文件[2][3]。

一、原理

KB 纸片法的理论基础是药物扩散动力学。含药纸片贴在接种了待测菌的 Mueller-Hinton（M-H）琼脂表面后，药物以纸片为中心向周围琼脂扩散，形成从中心到外围递减的浓度梯度。同时，细菌在琼脂表面以近接方式生长。若药物浓度高于细菌的最低抑菌浓度（MIC），则该区域细菌不能生长，形成透明抑菌圈；抑菌圈边缘处的药物浓度恰好等于该菌的 MIC。抑菌圈直径的大小直接反映细菌对药物的敏感程度：圈越大，说明该药抑菌能力越强，MIC 越低[1][4]。

抑菌圈直径与 MIC 之间存在半对数线性关系，可通过回归方程相互推算。CLSI 基于这一关系，结合药物体内药代动力学特征（PK/PD），制定了各类抗菌药物的 S/I/R 折点（breakpoints），即抑菌圈直径的具体判读界值[3][4]。

二、操作流程

KB 纸片法操作分为以下几个关键步骤，全程须严格遵循 CLSI M02 规范[1][4][5]：

（1）培养基准备 使用 Mueller-Hinton 琼脂（MHA）平板，厚度 4 mm（约 20–25 mL/90 mm 平板）。平板在使用前需恢复至室温。MHA 必须符合 CLSI 规定的阳离子含量标准（Ca²⁺ 20–25 mg/L，Mg²⁺ 10–12.5 mg/L），以确保结果可重复[1][4]。

（2）菌悬液制备 从待测菌纯培养物上挑取单个菌落，悬浮于无菌生理盐水或肉汤中，调节浊度至 0.5 麦氏浊度标准（McFarland 0.5）。0.5 McFarland 标准相当于约 1×10⁸ CFU/mL 的细菌浓度。浊度不足或过度均会显著影响结果[1][4]。

（3）平板接种 用无菌棉拭子蘸取菌悬液，挤出多余液体，在 MHA 平板表面按三个方向均匀涂抹接种，确保整个平板形成均匀薄层菌苔。接种后静置 3–15 分钟，让平板表面水分吸收[1][4]。

（4）贴加药敏纸片 待平板表面稍干后，使用无菌镊子或自动分配器将含药纸片贴附于琼脂表面。纸片应轻压确保接触良好。纸片间距不小于 24 mm，纸片中心距平板边缘不小于 15 mm，以免抑菌圈重叠。同一平板通常可贴 6–12 张纸片[1][4]。

（5）培养 贴片后 15 分钟内将平板倒置（ agar 面朝下）放入 35°C ± 2°C 孵箱，培养 16–18 小时。对于万古霉素和葡萄球菌属、肠球菌属等特定组合，需培养 24 小时[1][4]。

（6）结果判读 培养结束后，用卡尺或自动读数仪测量每个抑菌圈的直径（mm），包括纸片本身。从平板背面测量，以细菌生长边界为准。抑菌圈内如有微小菌落生长（≤ 1% 菌苔），可忽略不计；若出现明显的卫星现象或拖尾，应考虑复验[1][4]。

判读结果严格依据 CLSI M100 文件所附折点表，将测量值与 S/I/R 界值比对，报告 S、I 或 R[3][4]。

三、应用场景

KB 纸片法适用于多种临床常见分离菌的药敏检测，主要包括[1][3]：

• 肠杆菌目（Enterobacterales）：如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、沙门菌属、志贺菌属等肠杆菌科细菌，是最常见的检测对象
• 非发酵革兰阴性杆菌：铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等
• 葡萄球菌属：包括金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌
• 肠球菌属：粪肠球菌、屎肠球菌等
• 部分链球菌属：肺炎链球菌、无乳链球菌等（需在 5% CO₂ 环境中培养）

对于苛养菌（如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌）、厌氧菌及部分真菌，KB 纸片法不适用或需采用专用培养基和条件，应参考 CLSI M45、M24 等专项文件[2][3]。

在以下场景中 KB 纸片法具有独特优势： - 基层医疗机构的常规药敏检测 - 新抗菌药物上市前的敏感性监测研究 - 医院感染流行病学调查 - 多重耐药菌的初筛

四、优缺点

主要优点： - 方法成熟，全球标准化程度高，跨实验室结果可比 - 成本低，无需特殊仪器，适合资源有限环境 - 操作学习曲线短 - 抑菌圈直观可视化，便于质控和结果复核 - 可同时检测多种药物，选择灵活

主要缺点： - 只能给出 S/I/R 定性结果，不能直接得到 MIC 值（可通过同片法或回归方程推算，但不如稀释法精确） - 对苛养菌、厌氧菌不适用 - 抑菌圈边界有时不清晰（拖尾现象、卫星菌落），判读存在主观性 - 操作各环节（浊度、接种量、培养时间）的标准化程度直接影响结果准确性

五、报告解读

一份规范的 KB 纸片法药敏报告包含以下核心信息[1][3]：

基本信息：患者姓名、标本类型、分离菌株名称、采样日期、报告日期。

药敏结果：以表格形式列出各抗菌药物的抑菌圈直径（mm）及对应的 S/I/R 判读结果。示例：

补充注释：部分药物需注明检测条件（如肺炎链球菌需在 5% CO₂ 下培养）；若检出 MRSA、ESBL 菌株等，报告应包含相关提示。

临床解读要点： - 敏感（S）：表示该菌株所致感染在常规剂量给药方案下达标概率高，可作为首选治疗药物 - 中介（I）：药物在体内浓度可能处于临界水平，疗效不确定；可在加大剂量或提高给药频率后考虑使用 - 耐药（R）：提示常规治疗方案下该药可能无效，不应选用

注意事项： 药敏结果必须结合临床实际情况（包括感染部位、患者基础疾病、免疫状态、抗菌药物在感染组织的渗透性等）综合判断，不能机械套用。CLSI M100 折点针对不同菌种、不同感染部位可能设有不同界值，解读时须查对相应表格[3]。

参考文献

[1] American Society for Microbiology. Kirby-Bauer Disk Diffusion Susceptibility Test Protocol[EB/OL]. Washington, DC: ASM, 2016. https://asm.org/getattachment/2594ce26-bd44-47f6-8287-0657aa9185ad/kirby-bauer-disc-diffusion-susceptibility-test-protocol-pdf.pdf.

[2] Clinical and Laboratory Standards Institute. M02—Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests, 14th Edition[EB/OL]. Wayne, PA: CLSI, 2024. https://clsi.org/shop/standards/m02/.

[3] Clinical and Laboratory Standards Institute. M100—Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, 36th Edition[EB/OL]. Wayne, PA: CLSI, 2026. https://clsi.org/shop/standards/m100/.

[4] Bauer A W, Kirby W M, Sherris J C, et al. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method[J]. Am J Clin Pathol, 1966, 45(4): 493-496.

[5] Centers for Medicare & Medicaid Services. Antimicrobial Disk Diffusion Susceptibility (Bauer, Kirby, Sherris and Turk Method)[EB/OL]. Baltimore, MD: CMS, 2004. https://www.cms.gov/files/document/sc04163pdf.

[6] Simner P J, Humphries R M. Clinical Microbiology Specific Guidance for Antimicrobial Susceptibility Testing[J]. J Clin Microbiol, 2022, 60(5): e0186421. DOI:10.1128/jcm.01864-21.

[7] Clinical and Laboratory Standards Institute. M45—Methods for Antimicrobial Dilution and Disk Susceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidious Bacteria, 4th Edition[EB/OL]. Wayne, PA: CLSI, 2022.

[8] Jorgensen J H, Turnidge J D. Susceptibility Test Methods: Dilution and Disk Diffusion[M]// Versalovic J, et al. Manual of Clinical Microbiology, 10th ed. Washington, DC: ASM Press, 2011.