【检测技术科普】2026-07-05 三代测序（Nanopore/PacBio）详解

概述

测序技术自 1977 年 Sanger 法诞生以来，已经历三次代际跃迁：以 Illumina 为代表的第二代短读长测序（NGS）主导了过去十余年的临床基因组学，而以单分子实时（SMRT, PacBio）和纳米孔（Nanopore, Oxford Nanopore Technologies, ONT）为代表的三代测序（TGS, third-generation sequencing）则以超长读长、实时产出、便携性、表观遗传可读等特性，正在重塑感染性疾病诊断、病原体基因组监测、耐药基因鉴定等多个场景。

三代测序的两大主流平台分别走两条路线： - PacBio SMRT 基于零模波导（ZMW, zero-mode waveguide）单分子实时荧光检测，主要产品有 Sequel II/IIe 与 Revio 系统； - Oxford Nanopore (MinION/GridION/PromethION) 基于膜孔蛋白电流信号检测，以 MinION 的「U盘大小」和实时碱基识别著称。

本文从原理、操作流程、感染病学典型应用、优缺点、报告解读五个方面系统介绍三代测序技术，帮助临床医生、检验技师与公卫人员建立技术与应用认知。

一、原理

（一）PacBio SMRT 测序原理

SMRT 测序的核心是零模波导孔（ZMW）——一种直径约 70 nm、深 70 nm 的纳米孔结构，光学检测体积仅约 20 泽升（10⁻²¹ L）。

• 单分子 DNA 聚合酶被固定于 ZMW 底部，四种 dNTP 的磷酸基团上分别标记四种不同颜色的荧光基团；
• 当 DNA 聚合酶沿模板链合成新链时，被加入的 dNTP 因处于 ZMW 激发光有效体积内产生荧光脉冲；
• 掺入完成后磷酸基团连同荧光基团一并被剪切释放，离开 ZMW 后信号消失，从而保证连续、逐碱基的高分辨率读取；
• HiFi（CCS, circular consensus sequencing）模式利用「发夹接头 + 滚动测序」策略，对同一 DNA 模板多次循环读取，借助一致性算法将单读长错误率从约 10–15% 校正至 Q30 以上（>99.9%），最终产生 10–25 kb 的高保真长读段（HiFi reads）[1]。

PacBio 测序过程中聚合酶合成速度与碱基修饰状态会同时影响荧光脉冲的动力学参数（IPD, inter-pulse duration），因此可在不依赖亚硫酸氢盐处理的情况下直接检测 N6-甲基腺嘌呤（6mA）、5-甲基胞嘧啶（5mC）等表观修饰。

（二）Oxford Nanopore 测序原理

Nanopore 的核心是嵌在电阻高分子膜上的马达蛋白＋纳米孔蛋白复合体（常用 α-溶血素或 CsgG 衍生孔）。

• 测序体系两侧施加恒定电压（通常约 –180 mV 至 –300 mV）；
• 当带负电的 DNA 或 RNA 单链被马达蛋白按 4–6 Å/s 的速度牵入纳米孔时，碱基本身的环状结构对流过孔道的电流产生幅度约 pA 级别的特征性阻断；
• 这种「电流指纹」经深度学习 basecaller（如 Guppy / Dorado）解码为碱基序列，无需荧光、无需合成；
• 测序为实时进行：每条 read 边测边进入 FASTQ 文件，理想条件下可在数分钟到数小时内获得初步结果；
• 同一物理原理也可用于直接 RNA 测序、甲基化检测（基于修饰后的电流差异），读长可达 2 Mb 以上（超长读长方案）[3]。

（三）三代 vs. 二代：本质区别

二、操作流程

临床样本从采集到测序报告大致经历五步，以 Nanopore 病原体靶向测序（NTS）为例：

1. 样本前处理与核酸提取 - 血液、痰液、肺泡灌洗液、脑脊液、组织匀浆等使用商品化试剂盒（如 QIAamp DNA Mini Kit）提取总 DNA/RNA； - 部分方案（如 ARapidTb）已实现直接从痰液热保护一步破碎 上机，省去常规培养时间[6]。

2. 文库构建（library preparation） - 靶向扩增子方案（NTS / tNGS）：使用多重 PCR 靶向 16S rRNA、ITS、rpoB/katG/inhA/gyrA 等病原特异性位点；扩增子大小可设计至 1–4 kb 以充分利用长读长优势[5][6]； - 宏基因组方案（mNGS/tNGS-metagenomic）：随机片段化 + 接头连接 + barcode 标记，常用 SQK-RBK110.96 等 Rapid Barcoding 试剂盒，可在 1–2 h 内建库完成[5]； - PacBio HiFi 方案：SMRTbell 文库为「哑铃型」单链环（两侧含相同接头），便于滚动测序。

3. 上机测序 - MinION Mk1B：常配 R9.4.1 / R10.4.1 flow cell，~75 μL 文库上样后启动 MinKNOW 控制软件； - 实时监控 Q 值、pore 占用率、reads 数； - PacBio Revio：单 SMRT Cell 含 2,500 万 ZMW，单次运行 24 h 可生成 ~90 Gb HiFi 数据[2]。

4. 实时碱基识别与 QC - Nanopore 边测边 basecall（high-accuracy / super-accuracy 模式）； - 过滤 Q<7 的 reads； - 关键读段（≥1 kb、Mapping Q≥60）保留用于下游。

5. 生物信息学分析 - 病原体鉴定：Minimap2 对齐至参考基因组、EPI2ME/wf-tb-amr、Kraken2、What'sHap 等工具； - 耐药基因检测：bcftools、clair3、Mykrobe、SAM-TB 等，基于 WHO 突变目录（Mycobacterium tuberculosis 2nd edition, 2023）进行耐药注释[4]； - 系统发育与传播链推断：基于 SNP/全基因组比对绘制时间树。

临床上从样本到报告的端到端最短耗时：

• 病原体靶向测序（如 TB-DR）：8–24 h（直接从痰液样品）[4][6]；
• 病原体宏基因组 mNGS：6–24 h；
• 全基因组 + 耐药分析：24–48 h；
• 实时「边测边读」最早可在 15 min 得到初步识别（机场/口岸/暴发现场）[3]。

三、应用场景

（一）结核分枝杆菌复合群（MTBC）与耐药鉴定

WHO 估计 2023 年全球新发结核约 1,080 万例（95% CI: 1,030–1,130 万），耐多药结核（MDR-TB）/利福平耐药结核（RR-TB）患者约 40 万例；全球 TB 仍是单一病原体致死首位的传染病之一（WHO Global TB Report 2024 [7]）。传统表型药敏需 2–6 周。

• Schwab 等 2025 年在南非与赞比亚开展的现场评估 显示，Nanopore TB-DR tNGS 对痰液标本的耐药检测灵敏度（以表型 DST 为参照）良好，且具备在 24 h 内「样品入→报告出」的能力[4]；
• ARapidTb（2025 年 Infection 发表） 单管多重 PCR 覆盖 10 个耐药决定基因全编码区，结合 Flongle/MinION flow cell 可在 12–24 h 内完成鉴定-预测[6]；
• tNGS 在结核性浆膜腔积液（胸水/腹水/心包积液）等低菌量标本上阳性率优于传统 MGIT 培养（2026 年 Frontiers in Medicine 多中心研究）[8]。

（二）血流感染（BSI）与中枢神经系统感染

• 2024 年 Journal of Infection 报道基于 Nanopore NTS 的 114 种病原＋27 种耐药基因（Bacteria 57 + Viruses 21 + Fungi 17 + 特殊 12 + Parasites 7）联合检测，目标是 6 h 内完成血样本鉴定[5]；
• 2025 年 Journal of Clinical Neuroscience 报道在术后颅内感染（PCNSI）患者中，Nanopore 阳性率 79.41%（27/34），显著高于 mNGS（73.53%）和培养（55.88%），且与最终诊断一致性 Kappa = 0.717[9]。

（三）呼吸道感染与宏基因组

• mNGS 在下呼吸道感染、肺部感染宏基因组学方面，Nanopore 6 h 即获得病原与早期耐药信号，可在培养阴性样本中识别苛养菌（Legionella、Nocardia、分枝杆菌等）[3]。

（四）暴发溯源与现场基因组学

• 2018 年西非拉沙热（Nigeria）暴发：MinION 在缺乏二代测序条件的尼日利亚国家级实验室完成现场测序，证实病毒由啮齿类传播，从而将防控干预重点调整为灭鼠与粮食储存[3]；
• 后续在埃博拉、寨卡、SARS-CoV-2 等疫情中，MinION/GridION 均承担了快速测序现场化的功能[3]；
• 中国海关、CDC 也在口岸与重大活动保障中部署便携测序仪用于输入性病原的快速鉴定。

（五）耐药基因定位与可移动元件

PacBio / Nanopore 长读长能跨越整个重复区域或质粒，一次性读出耐药基因的染色体/质粒定位、拷贝数与周围可移动元件结构，这是二代短读长无法轻易解析的[1][2][3]。

（六）RNA 病毒与转录组

• 直接 RNA 测序可保留原始 RNA 修饰，分析 SARS-CoV-2、HSV-1、VZV 等的结构变异与转录本[3]；
• 长读长 cDNA（PacBio Iso-Seq / Kinnex）可解析病原微生物（如 Neisseria、Mycoplasma）的操纵子、可变剪接与质粒多样性。

（七）甲基化与宿主–病原互作

PacBio SMRT 与 Nanopore 信号差异均可直接识别 6mA、5mC 修饰，因此可在同一建库条件下同时获得病原单倍型、毒力基因表达调控线索[1][2]。

四、优缺点

（一）主要优势

1. 长读长：可以从头（de novo）拼接完整的细菌基因组、解析重复序列与质粒结构；
2. 实时、可便携：MinION 设备约 100 g，可现场测序（田间、病房、口岸、疫区）；单反应最快数十分钟即可读到第一批数据[3]；
3. 直接表观读出：无需亚硫酸氢盐转化即可识别 6mA/5mC[1]；
4. PCR-free / 偏好性低：单分子测序无 PCR 扩增偏好，对高 GC / 高 AT 区域均一性较好；
5. 可在同一文库中混合不同大小产物：长、短片段在同一 flow cell 中定相（phasing）[5]；
6. PacBio HiFi 高准确度：经 CCS 校正可达 Q30+，与短读长二代测序准确性相当；
7. 多平台协同：Nanopore 与 PacBio 长读长+Illumina 短读长的混合组装（hybrid assembly）常用于临床疑难菌株的完整基因组构建[1]。

（二）主要局限

1. 原始错误率较二代高：Nanopore 单读错误率约 5–15%（R10.4.1 + Dorado super-accuracy 模式可降至 ~0.1%），PacBio CLR 早期模式也较高；需要靠测序深度（≥30×）或 HiFi CCS 多轮覆盖校正；
2. 宿主核酸污染：临床样本中宿主 DNA 占绝大多数，靶向扩增（amplicon）或探针捕获（adaptive sampling） 才能提高灵敏度[5]；
3. 单位碱基成本仍高于二代 bulk re-sequencing，但对突发/单样本场景，TGS 的总周转时长远胜于二代；
4. 数据分析门槛高：需要相对充足的计算资源、专门流程与质量控制；
5. 法规与质控：TGS 在体外诊断（IVD）领域的注册/认证标准、判读阈值仍处于完善阶段，临床报告需明确所用方法学、质控品；
6. 设备与试剂成本、售后体系：低收入国家在 TB 等重大公共卫生场景仍需依靠 WHO 推荐和公益基金支持。

五、报告解读

临床医生在收到三代测序报告时建议关注以下条目：

1. 样本与上样信息 - 样本类型、采集时间、储存条件； - 内对照（internal control）是否达标； - Qubit / Nanodrop 检测的核酸浓度、A260/A280 纯度。

2. 测序质量指标 - 总 reads 数、Q30 比例、平均读长、N50； - 每个 barcode 的 reads 数与目标覆盖度； - 空白对照（no-template control, NTC）阴性是否成立——这是 mNGS/NTS 报告可信度的必要前提。

3. 病原识别结果 - 报告通常分「确定性」与「疑似性」两个层级（与空白/环境/试剂背景比对后给出相对丰度、覆盖深度、特异 reads 数）； - 临床判读需结合：① 临床症状与体征；② 影像学（CT/MRI）；③ 常规实验室结果（WBC、CRP、PCT、培养、PCR、mNGS 等）；④ 重复采样结果。

4. 耐药基因注释 - WHO 突变目录（如 TB-DR 解读使用 2023 年第 2 版）、CARD 数据库、ResFinder 等； - 区分「已确认耐药」「预测耐药」「意义未明（VUS）」； - 表型复核：对关键样本仍建议送传统 DST 复核。

5. 系统发育与传播信息 - 出示基于 SNP/全基因组的系统发育树、谱系（lineage）； - 对暴发追踪，报告可附 SNP distance 矩阵提示潜在传染链。

6. 限度声明 - 报告必须明确：① 本次测序的最低检出限（LOD）；② 不能完全排除的技术局限（如宿主 DNA 干扰、低丰度变异、de novo 装配区域）；③ 与临床综合判断的关系。

7. 典型判读误区 - ❌ 把「环境/试剂背景序列」误判为感染病原——务必读取 NTC； - ❌ 把 mNGS 检出与感染直接等同——需符合「定植？污染？致病原？」三级判读； - ❌ 忽视「同一菌种不同菌株」的临床意义——长读长恰恰可分辨单倍型差异； - ❌ 用一代、二代报告解读习惯对待 TGS——读长、覆盖度、错误模型不同。

参考文献

[1] Ardui S, Ameur A, Vermeesch J R, et al. Single molecule real-time (SMRT) sequencing comes of age: applications and utilities for medical diagnostics[J]. Nucleic Acids Research, 2018, 46(5): 2159-2168. DOI: 10.1093/nar/gky066.

[2] Rhoads A, Au K F. PacBio sequencing and its applications[J]. Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 2015, 13(5): 278-289. DOI: 10.1016/j.gpb.2015.08.002.

[3] Feng Y, Zhang Y, Ying C, et al. Portable sequencer in the fight against infectious disease[J]. Journal of Human Genetics, 2019, 65(1): 35-43. DOI: 10.1038/s10038-019-0675-4.

[4] Schwab T C, Joseph L, Moono A, et al. Field evaluation of nanopore targeted next-generation sequencing to predict drug-resistant tuberculosis from native sputum in South Africa and Zambia[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2025, 63(5): e01390-24. DOI: 10.1128/jcm.01390-24.

[5] Yang Q, Rui Y, Wang X, et al. Molecular rapid diagnostic testing for bloodstream infections: Nanopore targeted sequencing with pathogen-specific primers[J]. Journal of Infection, 2024 (Elsevier). DOI: 10.1016/j.jinf.2024.106249.

[6] Liu X, Wang Y, Liu Z, et al. Targeted sputum sequencing for rapid and broad drug resistance of Mycobacterium tuberculosis[J]. Infection, 2025. DOI: 10.1007/s15010-024-02463-y.

[7] World Health Organization. Global tuberculosis report 2024[M]. Geneva: WHO, 2024.

[8] Zhang L, Liu H, Wang K, et al. Nanopore-targeted sequencing for rapid and accurate diagnosis of tuberculous serous effusions: a prospective evaluation across pleural, peritoneal, and pericardial fluids[J]. Frontiers in Medicine, 2026, 13: 1826173. DOI: 10.3389/fmed.2026.1826173.

[9] Chen Y, Liu Y, Zhao M, et al. Pathogen diagnostic value of nanopore sequencing in postoperative central nervous system infections[J]. Journal of Clinical Neuroscience, 2025. DOI: 10.1016/j.jocn.2025.110280.

[10] 中国防痨协会, 中国疾控中心结核病控制中心. 结核病病原学检测技术规范（2024 年版）[EB/OL]. 北京: 中国防痨协会, 2024-12-01[2026-07-05]. https://www.china-tb.org.

[11] Oxford Nanopore Technologies. Technical documentation: MinION and GridION[EB/OL]. Oxford: ONT, 2025[2026-07-05]. https://nanoporetech.com/document.